Erzeugung von Maus-knock-out-Modellen für die Sulfatasen Sulf1, Sulf2 und Arylsulfatase G

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Maus-knock-out-Modelle für die Sulfatasen Sulf1, Sulf2 und Arylsulfatase G (ASG) unter Verwendung der gene-targeting-Methode generiert. Erste in-vitro-Experimente konnten Sulf1 eine bedeutsame Funktion für embryonale Differenzierung, Homöostase und andere wesentliche Prozesse zuschreiben, die über Heparansulfat-abhängige Signaltransduktionswege gesteuert werden. Die Rolle der zu Sulf1 stark homologen Sulf2 und der ASG ist bislang unerforscht. Für den Gen-knock-out wurde die klassische, nicht-konditionale Strategie gewählt.Zunächst wurden die murinen cDNAs in Form von EST-Klonen erhalten und charakterisiert. Durch Screening der genomischen Cosmid-Bibliothek der 129/Ola-Maus mit radioaktiv markierten cDNA-Sonden wurden Cosmide identifiziert, die Genabschnitte der drei Sulfatasen enthielten. Die Cosmide wurden auf das Vorhandensein der interessierenden Exon-/Intron-Bereiche mittels Southernblot untersucht. Die positiven Cosmide wurden durch Restriktionskartierung und Sequenzanalyse charakterisiert. 3.1 bis 3.8 kb große Abschnitte der Cosmid-DNA, die eines der beiden ersten Exons des jeweiligen Sulfatase-Gens mittig enthielten, wurden subkloniert und zur Konstruktion der gene-targeting-Vektoren eingesetzt. Es wurde das Aminoglykosid-Phosphotransferase-Gen, das den Zellen Resistenz gegenüber Aminoglykosidantibiotika wie G418 verleiht, als positiver Selektionsmarker in das Exon eingeführt, und so dessen Leserahmen unterbrochen. Diese Konstrukte wurden durch Elektroporation in embryonale Stammzellen transfiziert, die anschließend in G418-haltigem Selektionsmedium kultiviert wurden. Jeweils ca. 100 G418-resistente ES-Zell-Klone wurden isoliert und auf erfolgte homologe Rekombination des Konstruktes unter Verwendung externer sowie interner DNA-Sonden mittels Southernblot überprüft. Positive ES-Zell-Klone wurden kryokonserviert sowie für die Blastozysteninjektion vorbereitet.Nach erfolgter Blastozysteninjektion und Retransfer in den Uterus pseudoträchtiger Mäuse wurden Chimären erhalten, deren Verpaarung mit C57BL/6-Mäusen die heterozygote F1-Generation ergab. Daneben wurden die Chimären mit 129/Ola-Weibchen verpaart, um Tiere mit einem genetisch reinen 129/Ola-Hintergrund zu erhalten. Durch Verpaarung der Tiere der F1-Generation wurden in der F2-Generation für das SULF1- bzw. SULF2-Null-Allel homozygote Tiere mit reduzierter, von den Mendelschen Regeln abweichender Häufigkeit erhalten. Kürzlich konnten auch erste ASG-knock-out-Mäuse erhalten werden, zu denen gegenwärtig noch keine Aussagen gemacht werden können. Die Sulf1- bzw. Sulf2-knock-out-Mäuse sind fertil, so dass sie zur weiteren Verpaarung eingesetzt werden können. Die SULF1-/- - Tiere zeigen keinen äußerlich erkennbaren Phänotyp, sie sind nach dem Abschluss der Wachstumsphase im Durchschnitt 1.8 g schwerer als die WT-Mäuse. Etwa 40% der SULF2-/- - Mäuse versterben im Alter von 1-6 Wochen und zeigen diverse ZNS-Missbildungen wie Hydrozephalus oder Hypo- bzw. Aplasie des Corpus callosum. Die restlichen SULF2-/- - Tiere sind unauffällig. Doppel-Mutanten (SULF1-/- SULF2-/-) konnten bis jetzt nicht generiert werden, die Defizienz beider Sulfatasen scheint embryonal letal zu sein.Mit der Erzeugung dieser knock-out-Maus-Modelle werden weitere Studien der Funktion der neuen Sulfatasen Sulf1 und Sulf2 sowie der ASG im Zusammenhang des Gesamtorganismus ermöglicht. Abgeleitete Zelllinien werden bereits zur Identifizierung der natürlichen Substrate dieser Sulfatasen und für funktionelle in-vitro-Untersuchungen eingesetzt.