Das Kontraktionsverhalten isolierter humaner Kardiomyozyten unter den Bedingungen der primären Zellkultur und des virusvermittelten Gentransfers:Einfluß von Frequenzänderung, ß-adrenerger Stimulation und Änderung der extrazellulären Calcium-Konzentration
Contractile behavior of human isolated myocytes under the conditions of cell culture and adenovirus-mediated gene transfer: effects of increasing stimulation rates, ß-adrenergic stimulation and changes in extracellular calcium
by Elke Barbara Seehase
Date of Examination:2012-01-16
Date of issue:2012-01-09
Advisor:Prof. Dr. Burkert Pieske
Referee:Prof. Dr. Burkert Pieske
Referee:Prof. Dr. Thomas Paul
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Adenovirus-mediated gene transfer into cardiomyocytes has emerged as an interesting tool to study functional effects of single proteins. However, the functional consequences of cell isolation, cell culture per se and adenovirus-mediated transfer warrant further investigation. Thus, functional behavior of human isolated myocytes from end stage failing hearts was assessed directly after isolation, after 24/ 48h cell culture, respectively, and after adenoviral mediated gene transfer of ß-Galactosidase (ß-Gal) under basal conditions (field stimulation, 0.5 Hz, 37 degrees C), during increasing stimulation rates, inotropic stimulation with isoproterenol, or rising extracellular Calcium concentrations. After enzymatic digestion via coronary perfusion, freshly isolated myocytes, but also cultured myocytes, showed inotropic competence, although cultured cells showed slower contraction and relaxation kinetics, their basal contraction amplitude was slightly smaller and the concentration-response curve for isoproterenol was shifted to the left. Adenoviral mediated gene transfer caused efficient ß-Gal expression with impaired contractile amplitude. CONCLUSION: Isolated Myocytes were functionally competent, it was possible to use them for cell culture and adenovirus mediated gene tranfer. The method-related changes in contractile behavior observed here need to be taken into account in further studies.
Keywords: heart failure; human myocardium; isolated cardiomyocytes; cell culture; gene transfer
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Adenoviral vermittelter Gentransfer ist eine verbreitete Methode, um die Auswirkungen veränderter Proteinexpression auf Zellfunktionen zu erforschen. Es ist allerdings wenig darüber bekannt, ob und inwieweit alleine die Bedingungen der dazu erforderlichen Zellkultur und der viralen Infektion als solcher die Funktion isolierter humaner Kardiomyozyten verändern. In der vorliegenden Arbeit wurde daher das Verhalten isolierter, terminal insuffizienter humaner Kardiomyozyten direkt nach Isolation und unter Zellkulturbedingungen nach 24 und 48 Stunden sowie nach adenoviral vermitteltem Gentransfer des nicht-Funktionsproteins ß-Galaktosidase (ß-Gal) untersucht. Das Kontraktionsverhalten wurde unter Basalbedingungen (37°C, Feldstimulation, 0,5 Hz), unter ansteigender Stimulationfrequenz sowie unter inotroper Stimulation mit dem ß-Adrenozeptoragonisten Isoprenalin bzw. mit erhöhter extrazellulärer Calciumkonzentration getestet. Mittels enzymatischer Digestion via Koronarperfusion konnten funktionstüchtige Zellen gewonnen werden, die im direkt anschließenden Experiment, aber auch nach bis zu zwei Tagen Zellkultur bei physiologischen Temperaturen und extrazellulären Calciumkonzentrationen stabil isotonisch kontrahierten. Die kultivierten Zellen benötigten mehr Zeit für Kontraktion und Relaxation, und die Amplitude der basalen Kontraktion war geringfügig verringert, die Isoprenalin- Konzentrations-Wirkungs-Kurve war linksverschoben. Der adenoviral ermittelte Gentransfer resultierte in einer histochemisch nachweisbaren ß-Gal-Expression. Die basale Kontraktionsamplitude der betreffenden Zellen lag deutlich unter derer der nichtinfizierten Zellen, während sich die übrigen Parameter nicht signifikant von denen der kultivierten Zellen unterschieden. ZUSAMMENFASSUNG: Aus insuffizientem Humanmyokard können funktionstüchtige Kardiomyozyten gewonnen werden, die sich auch viral infizieren und kultivieren lassen. Der Einfluß von Zellkultur, viraler Infektion und veränderter Proteinexpression auf das kontraktile Verhalten der Zellen darf jedoch nicht außer Acht gelassen werden.
Schlagwörter: Herzinsuffizienz; Humanmyokard; isolierte Kardiomyozyten; Zellkultur; Gentransfer