Molekulare Analyse eines Homöobox-Gen-Promotors in der Gehirnanlage von Wirbeltierembryonen

Abstract

Die Mitglieder der ANF-Homöobox-Genfamilie gehören zu den frühesten Markern für das anteriore zentrale Nervensystem im Wirbeltierembryo. Bei einem Verlust ihrer Genaktivität in der Maus fallen morphologische Veränderungen im Bereich der Mittellinie des Gehirns auf (Septum pellucidum, kommissurale Axone und Hypophyse). Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Aspekten der Transkription der ANF-Homöobox-Gene. Im Mittelpunkt steht die Untersuchung des Promotors des orthologen Genes des Huhnes, GANF. Die GANF-Promotor-Region wurde im Rahmen dieser Arbeit auf 600 bp eingegrenzt, die ausreichend sind, um die Expression im Hühnerembryo zu kontrollieren. Diese Region ist konserviert in Maus, Mensch, Huhn und Frosch. Es konnte ferner gezeigt werden, dass dieser Bereich ebenfalls im Zebrafisch für die Steuerung der Expression ausreicht, nicht aber im Mausembryo. Dies korrespondiert mit bereits gefundenen Unterschieden zwischen GANF bzw. DANF auf der einen Seite und Hesx1 auf der anderen in Bezug auf die zusätzliche Expressionsdomäne von Hesx1 im anterioren viszeralen Endoderm (AVE) bzw. unterschiedliche Mechanismen der Induktion anteriorer neuraler Strukturen im Huhn bzw. Zebrafisch und den Säugetieren. Mit dem Ziel, Interaktionspartner des GANF-Promotors zu finden, wurden Bindungsstellen aus dem gefundenen Promotorbereich näher untersucht. Für eine Bindestelle von Pax6 und zwei Bindestellen von Otx2 konnten sowohl die Bindungen als auch eine signifikant reduzierte Bindung an ein entsprechend mutiertes Oligonukleotid gezeigt werden. Für eine potenzielle Bindungssequenz von GANF konnte diese Spezifität nicht gezeigt werden. Um die Reporterkonstrukte gemäß der frühen Expression von GANF auch in sehr jungen Embryonen zu untersuchen, wurde eine neue Elektroporationsvariante entwickelt und im Labor etabliert, die es im Gegensatz zur In-ovo-Elektroporation von Hühnerembryonen erlaubt, sehr junge Embryonen (HH4 -HH 14) mit hoher Effizienz zu elektroporieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Untersuchung von an Septo-optischer Dysplasie (SOD) erkrankten Patienten der Universitätsklinik Göttingen auf Mutationen im menschlichen GANF-Ortholog HESX1 begonnnen. HESX1 ist an dem Zustandekommen der SOD beteiligt. Bei der Sequenzierung der DNA von bis jetzt einem Patienten wurden weder eine bekannte noch eine neue Mutation gefunden. Als Grund hierfür kommt eine mögliche genetische Heterogenität oder ein Funktionsverlust in einem noch nicht bekannten Enhancer in Frage.