Investigation of Protein - Protein Interactions in Clathrin-Mediated Membrane Transport

Abstract

Seitdem entdeckt wurde, dass die Rezyklierung synaptischer Vesikel (SV) kinetisch in zwei unterschiedlichen Phasen erfolgt, werden die zugehörigen molekularen Mechanismen kontrovers diskutiert. Diese Studie hatte zum Ziel, die molekularen Details der Rezyklierung SV in kleinen, zentralen Synapsen aufzuklären. Wir haben Methoden zur Inhibition der Clathrin-vermittelten Endozytose in primären, hippokampalen Neuronen entwickelt und deren Effekte auf die Endozytose SV durch Anwendung von FM1-43 Membranfarbstoffen und SynaptopHluorin analysiert. Im Zuge dieser Studien haben wir gefunden, dass der Großteil synaptischer Vesikel AP-2/Clathrin- und Dynamin-abhängig internalisiert wird. Schnelle und langsame Komponenten der SV Endozytose waren gleichermaßen betroffen.Während der grundlegende Mechanismus der Clathrin-vermittelten Endozytose generell gut verstanden ist, blieb bisher ungeklärt, wie spezifische SV Proteine von der Endozytose-Maschinerie erkannt werden. Genetische und biochemische Studien deuten darauf hin, dass das SV Membranprotein Synaptotagmin an der Kopplung von Exo- und Endozytose beteiligt ist. Wir haben Stonin 2 als einen Synaptotagmin-spezifischen endozytotischen Sortierungsadaptor identifiziert, der durch direkte Interaktion mit Synaptotagmin und AP-2 als Bindeglied zwischen Synaptotagmin und der Clathrin-Maschinerie fungiert. Sowohl die Wechselwirkung zwischen Synaptotagmin und Stonin 2 als auch die endozytotische Funktion von Stonin 2 sind abhängig von den Aminosäure-Resten KYE783-785, die in der µ-homologen Domäne (µHD) von Stonin 2 lokalisiert sind. Ferner implizieren unsere Daten einen synergistischen Effekt zwischen den beiden Synaptotagmin C2 Domänen im Hinblick auf Stonin 2 Bindung. Wenn die C2 Domänen allerdings einzeln angeboten werden, interagiert Stonin 2 hauptsächlich mit der C2A Domäne. Die C2B Domäne, wie auch die früher beschriebene direkte Interaktion zwischen AP-2 und Synaptotagmin, sind nicht notwendig für die AP-2/Stonin 2-abhängige Synaptotagmin Internalisierung in Fibroblasten. Wir vermuten, dass Stonin 2 als Linker zwischen Synaptotagmin und AP-2/Clathrin fungiert, indem es direkt mit den C2 Domänen assoziiert.Weiterhin ist es uns gelungen GIT1 (G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1) als neuen Stonin 2 Interaktionspartner zu identifizieren. Stonin 2 bindet direkt an die ARF-GAP (ADP ribosylation factor GTPase activating protein) Domäne von GIT1. Das könnte bedeuten, dass Stonin 2 eine regulierende Funktion auf die enzymatische Aktivität von GIT1 ausübt. GIT1 ist an zahlreichen zellulären Vorgängen beteiligt, wie beispielsweise an Umformungen des Zytoskeletts, die zur Zell-Motilität beitragen, an endosomalem Vesikeltransport und an der Synapsenbildung. Eine funktionelle Relevanz der Stonin 2 GIT1 Interaktion in einem oder mehreren dieser Prozesse muss noch nachgewiesen werden.