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Investigation of Protein - Protein Interactions in Clathrin-Mediated Membrane Transport

dc.contributor.advisorHaucke, Volker Prof. Dr.de
dc.contributor.authorJung, Nadjade
dc.date.accessioned2006-11-13T06:48:33Zde
dc.date.accessioned2013-01-18T14:25:21Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:18Zde
dc.date.issued2006-11-13de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B364-Ede
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-3235
dc.description.abstractSeitdem entdeckt wurde, dass die Rezyklierung synaptischer Vesikel (SV) kinetisch in zwei unterschiedlichen Phasen erfolgt, werden die zugehörigen molekularen Mechanismen kontrovers diskutiert. Diese Studie hatte zum Ziel, die molekularen Details der Rezyklierung SV in kleinen, zentralen Synapsen aufzuklären. Wir haben Methoden zur Inhibition der Clathrin-vermittelten Endozytose in primären, hippokampalen Neuronen entwickelt und deren Effekte auf die Endozytose SV durch Anwendung von FM1-43 Membranfarbstoffen und SynaptopHluorin analysiert. Im Zuge dieser Studien haben wir gefunden, dass der Großteil synaptischer Vesikel AP-2/Clathrin- und Dynamin-abhängig internalisiert wird. Schnelle und langsame Komponenten der SV Endozytose waren gleichermaßen betroffen.Während der grundlegende Mechanismus der Clathrin-vermittelten Endozytose generell gut verstanden ist, blieb bisher ungeklärt, wie spezifische SV Proteine von der Endozytose-Maschinerie erkannt werden. Genetische und biochemische Studien deuten darauf hin, dass das SV Membranprotein Synaptotagmin an der Kopplung von Exo- und Endozytose beteiligt ist. Wir haben Stonin 2 als einen Synaptotagmin-spezifischen endozytotischen Sortierungsadaptor identifiziert, der durch direkte Interaktion mit Synaptotagmin und AP-2 als Bindeglied zwischen Synaptotagmin und der Clathrin-Maschinerie fungiert. Sowohl die Wechselwirkung zwischen Synaptotagmin und Stonin 2 als auch die endozytotische Funktion von Stonin 2 sind abhängig von den Aminosäure-Resten KYE783-785, die in der µ-homologen Domäne (µHD) von Stonin 2 lokalisiert sind. Ferner implizieren unsere Daten einen synergistischen Effekt zwischen den beiden Synaptotagmin C2 Domänen im Hinblick auf Stonin 2 Bindung. Wenn die C2 Domänen allerdings einzeln angeboten werden, interagiert Stonin 2 hauptsächlich mit der C2A Domäne. Die C2B Domäne, wie auch die früher beschriebene direkte Interaktion zwischen AP-2 und Synaptotagmin, sind nicht notwendig für die AP-2/Stonin 2-abhängige Synaptotagmin Internalisierung in Fibroblasten. Wir vermuten, dass Stonin 2 als Linker zwischen Synaptotagmin und AP-2/Clathrin fungiert, indem es direkt mit den C2 Domänen assoziiert.Weiterhin ist es uns gelungen GIT1 (G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1) als neuen Stonin 2 Interaktionspartner zu identifizieren. Stonin 2 bindet direkt an die ARF-GAP (ADP ribosylation factor GTPase activating protein) Domäne von GIT1. Das könnte bedeuten, dass Stonin 2 eine regulierende Funktion auf die enzymatische Aktivität von GIT1 ausübt. GIT1 ist an zahlreichen zellulären Vorgängen beteiligt, wie beispielsweise an Umformungen des Zytoskeletts, die zur Zell-Motilität beitragen, an endosomalem Vesikeltransport und an der Synapsenbildung. Eine funktionelle Relevanz der Stonin 2 GIT1 Interaktion in einem oder mehreren dieser Prozesse muss noch nachgewiesen werden.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleInvestigation of Protein - Protein Interactions in Clathrin-Mediated Membrane Transportde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedInvestigation of Protein - Protein Interactions in Clathrin-Mediated Membrane Transportde
dc.contributor.refereeHaucke, Volker Prof. Dr.de
dc.date.examination2006-11-01de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaftende
dc.subject.dnbBiologiede
dc.description.abstractengEver since it was reported that synaptic vesicle (SV) retrieval follows two kinetic phases, the molecular mechanisms corresponding to these kinetic modes have been controversially discussed. This work aimed at elucidating the molecular details of SV recycling in small central synapses. We have generated tools to inhibit clathrin-mediated endocytosis (CME) in primary hippocampal neurons and analyzed their effects on SV retrieval using the optical tracers FM1-43 and synaptopHluorin. We found that the majority of SVs was recycled via an AP-2/clathrin- and dynamin-dependent pathway. Fast and slow components of SV retrieval were equally affected by CME inhibition. While CME as such is generally well understood, the question how select SV proteins are targeted for endocytosis has remained elusive. Genetic and biochemical studies have implicated the SV membrane protein synaptotagmin 1 (syt1) in connecting the exo- and endocytic limbs of the SV cycle. We have identified stonin 2 as syt1-specific endocytic sorting adaptor, which serves as linker between syt1 and the clathrin machinery by directly interacting with syt1 and AP-2 in vitro and in vivo. The interaction between stonin 2 and syt1, and the endocytic function of stonin 2 are directly dependent on residues KYE783-785 within the stonin 2 µ-homology domain (µHD). Our data indicate a synergistic effect between the syt1 C2 domains with respect to stonin 2 interaction, however, when C2 domains are offered separately, stonin 2 associates primarily with the C2A domain. We found that the C2B domain as well as the direct association of syt1 and AP-2 are dispensable for AP-2/stonin 2-dependent syt1 internalization in fibroblasts. We hypothesize that stonin 2 may serve as a linker between syt1 and AP-2/clathrin by directly recognizing syt1 C2 domains.In addition, we were able to identify the G protein-coupled receptor kinase interacting protein GIT1 as novel stonin 2 binding partner. Stonin 2 directly associates with the ADP-ribosylation factor GTPase activating protein (ARF-GAP) domain of GIT1, indicating a potential regulatory function of stonin 2 for the enzymatic activity of GIT1. GIT1 is involved in various processes such as cell motility by cytoskeletal rearrangements, trafficking between plasma membrane and endosomal compartments, or synapse formation. The functional relevance of the stonin 2 GIT1 interaction for one or more of these processes remains to be unraveled.de
dc.contributor.coRefereeJahn, Reinhard Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeNeher, Erwin Prof. Dr.de
dc.subject.topicMolecular Biology & Neurosciences Programde
dc.subject.gerClathrin-vermittelte Endozytosede
dc.subject.gersynaptische Vesikelde
dc.subject.gerAP-2de
dc.subject.gerSynaptotagminde
dc.subject.gerStonin 2de
dc.subject.engclathrin-mediated endocytosisde
dc.subject.engsynaptic vesicle recyclingde
dc.subject.engAP-2de
dc.subject.engsynaptotagminde
dc.subject.engstonin 2de
dc.subject.bk42.00 Biologie: Allgemeinesde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1337-1de
dc.identifier.purlwebdoc-1337de
dc.affiliation.instituteGöttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und molekulare Biowissenschaften (GGNB)de
dc.subject.gokfullWA 000 Biologiede
dc.subject.gokfullAllgemeinesde
dc.identifier.ppn579210286de


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