Simulation of Fluorescence Spectroscopy Experiments
Simulation fluoreszenzspektroskopischer Experimente
by Gunnar Schröder
Date of Examination:2004-10-06
Date of issue:2005-05-06
Advisor:PD Dr. Helmut Grubmüller
Referee:Prof. Dr. Tim Salditt
Referee:PD Dr. Helmut Grubmüller
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Name:schroeder.pdf
Size:6.84Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Fluorescence spectroscopy in combination with site-directed fluorescent labeling of biomolecules like proteins or DNA has become a standard tool in molecular biology and biochemistry to study interactions and conformational dynamics of biomolecules. The goal of this work was to contribute, by analysis and simulation, to the structural interpretation of fluorescence anisotropy and fluorescence resonance energy transfer (FRET) experiments at the atomic level. To this aim, different approaches have been developed and applied.The first step aimed at improving the analysis of single-molecule FRET experiments. Single-molecule methods demand for analysis methods which particularly account for the typically small number of observed events. In the case of single-molecule FRET experiments, the challenge is to determine the distance and distance fluctuations of two fluorescent dyes from only few detected photons. We developed a maximum-likelihood theory to reconstruct distance trajectories from single molecule FRET experiments.In a second contribution, we developed the LMLA-algorithm to compute principal curvilinear coordinates from molecular ensembles. To extract main structural features of an ensemble generated by a molecular dynamics (MD) simulation, the common approach is the principal component analysis (PCA), which yields a linear principal coordinate. However, in this work, as in many other situations, the motion of interest was the rotational dynamics of a fluorescent dye, which demanded for principal curvilinear coordinates.The third contribution concerned MD simulations of fluorescence anisotropy decay experiments. To study how information on the protein dynamics can be extracted from the fluorescence anisotropy of a bound dye, we performed molecular dynamics simulations of an Alexa488 dye covalently bound to the loop connecting the A- and B-helix of bacteriorhodopsin. The fluorescence anisotropy decay predicted by the simulation agrees well with the experimental results. Analysis of the correlation between the dye and the protein motions provides an atomistic description of the part of the protein dynamics, that is actually observed in the experiment. Furthermore, comparison of simulations with and without bound dye enabled us to test the inevitable assumption that in the experiment the influence of the dye on the protein dynamics is negligible. Indeed, only minor deviations in the loop flexibility were seen, thus providing solid theoretical grounds for the usual interpretation of the measurements.
Keywords: single-molecule; FRET; molecular dynamics simulation; fluorescence anisotropy
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Fluoreszenz-Spektroskopie in Kombination mit orts-spezifischer Fluoreszenzmarkierung ist mittlerweile zum Standardwerkzeug der Molekularbiologie und Biochemie zur Untersuchung der Wechselwirkungen und der konformationellen Dynamik von Biomolekülen geworden. Das Ziel dieser Arbeit war es, zur strukturellen Interpretation von Fluoreszenzanisotropie- und Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Experimenten durch Analyse und Simulation in atomarem Detail beizutragen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Ansätze entwickelt und angewandt.Im ersten Schritt wurde eine Verbesserung der Analyse von Einzelmolekül-FRET (smFRET) Experimenten angestrebt. Einzelmolekül-Techniken erfordern Methoden der Analyse die speziell der typischerweise geringen Zahl von beobachteten Ereignissen gerecht werden. Im Falle von smFRET-Experimenten besteht die Aufgabe darin Abstände und Abstandsfluktuationen von zwei Farbstoffen aus nur wenigen detektierten Photonen zu bestimmen. Daher wurde eine Maximum-Likelihood Methode zur Rekonstruktion von Abstandstrajektorien aus smFRET-Experimenten entwickelt.Im zweiten Beitrag wurde der LMLA-Algorithmus zur Berechnung krummliniger Hauotkoordinaten aus molekularen Ensembles entwickelt. Der herkömmliche Weg um wesentliche strukturelle Merkmale aus einem Ensemble, welches aus einer Molekulardynamik(MD)-Simulation gewonnen wurde, zu extrahieren, ist die Hauptkomponentenanalyse. Diese liefert allerdings nur lineare Hauptkoordinaten. In dieser Arbeit war jedoch die Rotationsbewegung eines Fluoreszenzfarbstoff von Bedeutung, welche die Bestimmung von krummlinigen Hauptkoordinaten erforderlich machte.Der dritte Beitrag beschäftigte sich mit der MD-Simulation von Fluoreszenzanisotropie-Experimenten. Um zu untersuchen, wie Informationen über die Proteindynamik aus der Fluoreszenzanisotropie eines gebundenen Farbstoffs erhalten werden können, wurden MD-Simulationen eines Alexa488 Farbstoffs, der kovalent an die AB-Schleife von Bacteriorhodopsin gebunden ist, durchgeführt. Die von der Simulation vorhergesagte Fluoreszenzanisotropie stimmt gut mit den experimentellen Ergebnissen überein. Die Analyse der Korrelation zwischen Farbstoff- und Proteinbewegung liefert eine atomistische Beschreibung des Teils des Proteins, dessen Bewegung im Experiment beobachtet wird. Durch den Vergleich mit zusätzlichen Simulationen ohne den Farbstoff, konnte die im Experiment notwendige Annahme, dass der Farbstoff keinen wesentlichen Einfluss auf die Proteindynamik hat, getestet werden. In der Tat konnte nur eine kleine Abweichung der Schleifenflexibilität beobachtet werden, welches eine solide theoretische Grundlage für die herkömmliche Interpretation der Messungen liefert.
Schlagwörter: Einzelmolekül; FRET; Molekulardynamiksimulation; Fluoreszenzanisotropie