Actin Filaments and Bundles in Flow
Aktinfilamente und Bündel in Strömung
von Dagmar Regine Steinhauser
Datum der mündl. Prüfung:2008-05-29
Erschienen:2008-08-06
Betreuer:Dr. Thomas Pfohl
Gutachter:Prof. Dr. Tim Salditt
Gutachter:Prof. Dr. Stephan Herminghaus
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Name:steinhauser.pdf
Size:12.1Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Actin, a protein and major component of the cytoskeleton, is organized in vivo into filaments, bundles, and networks which play an important role in mechanical stability and cellular motility. Aside from their biological relevance, actin filaments can be used as model systems for semiflexible polymers to answer fundamental physical questions in polymer science. In the presented thesis, results are discussed which consider the behavior of single semiflexible polymers in the field of microfluidics. Moreover, microfluidic tools are also used to study the bundling of actin filaments in vitro.In the first part of this thesis, the behavior of semiflexible actin filaments in flow inside microchannels is investigated. The filaments are analyzed at different channel positions along a cross-section for different flow velocities. The results indicate that the microflow causes either elongation or bending of filaments. Predominately, the filaments are elongated. The elongated filaments are nearly aligned in the flow direction. The elongation and alignment increase with larger flow velocities as it is seen in the end-to-end distance probability distributions and the angle probability distributions. The characteristic parameters of the filament orientation, the preferred angle and the width of the angle probability distribution, obey scaling laws which are known for strongly elongated or stiff polymers in simple shear flow. In addition to elongated filaments, tumbling of filaments is observed. The radii of curvature of bent filaments during tumbling decrease with increasing velocities. By balancing drag forces and bending forces, a scaling is derived with which the experimental values can be described. Additionally, bent filaments are also found at the channel center. In this region, the bent shapes are stable and can be quantified by parabolas. These bent conformations can be related to the non-monotonic parabolic velocity field, and the parabolic profiles can be reconstructed by modeling filament as elastic rods. Additionally to conformational and orientational studies of actin filaments in flow, an important point of interest is the channel positions along the cross-section at which filaments are most frequently found. The center-of-mass probability distributions show that the filaments are not equally distributed over the channel width. For large velocities, filaments are less frequently found near the channel center. Furthermore, depletion layers near walls are observed. Consequently, filaments migrate away from the channel center as well as away from the channel walls. The cross-streamline migration away from the channel center can be explained by a decrease of the filament diffusivity toward the walls due to an increase of the shear rate. Near walls, steric and hydrodynamic interactions with the walls lead to depletion layers. To quantify the spatially-varying diffusivity, the segment distributions of filaments at different channel positions as well as for different velocities are analyzed. Assuming proportionality between the diffusivity and the mean square deviation of segments from the center-of-mass streamline of filaments, the diffusivity at each channel position for a certain flow velocity can be determined. Using this diffusivity, a governing equation for the center-of-mass probability distribution is set up in which the spatially-varying diffusivity and hydrodynamic interactions with the walls can generate drift on the filaments. The calculated and measured distributions show the same essential characteristics like depletion layers at walls and the channel center.The second part of this thesis considers the actin bundling in the presence of linker molecules. Using microfluidic tools, a method is developed in order to observe the bundling of actin filaments in situ at a molecular level. The bundles are imaged by fluorescence microscopy and the intensity of the emitted light from a bundle is a measure for the number of filaments inside the bundle. Usage of a hydrodynamic focusing device enables a time-resolved visualization of the bundling from single filaments to thick bundles. As a result, it is shown that bundling is a diffusion-limited process. Furthermore, the analysis of thermal fluctuations of bundles characterizes their mechanical properties and a relation between the persistence length and the number of filaments is obtained. This relation suggests a weak coupling between filaments inside bundles, probably induced by the electrostatic nature of actin.
Keywords: actin; semiflexible polymer; microfluidic; bundle formation
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Das Protein Aktin ist eine wichtige Komponente des Zytoskeletts und wird in vivo in Filamente, Bündel und Netzwerke organisiert. Aktinfilamente gelten als Modellsysteme für semiflexible Polymere um grundlegende Probleme und Fragestellungen in der Polymerphysik zu beantworten. In der hier vorliegenden Arbeit werden Experimente zum Verhalten einzelner semiflexibler Filamente in mikrofluidischer Umgebung vorgestellt. Des Weiteren werden Methoden der Mikrofluidik zur Analyse der zeitlichen Entwicklung des Entstehens von Aktinbündeln verwendet.Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit den Eigenschaften der Aktinfilamente in Mikrokanälen im Fluss. An verschiedenen Stellen entlang eines Querschnitts des Kanals werden Filamente bei unterschiedlichen Geschwindigkeiten analysiert. Durch den Fluss im Mikrokanal werden die Aktinfilamente gestreckt oder gebogen, wobei gestreckte Filamente häufiger zu beobachten sind. Die Wahrscheinlichkeitsverteilungen des End-zu-End-Abstandes und des Winkels des End-zu-End-Vektors relativ zur Flussrichtung bei unterschiedlichen Geschwindigkeiten zeigen, dass die Streckung und Ausrichtung mit zunehmenden Geschwindigkeiten ansteigt. Die charakteristischen Orientierungsparameter, der bevorzugte Winkel und die Breite der Wahrscheinlichkeitsverteilung des Winkels, gehorchen den Skalengesetzen für steife oder stark gestreckte Polymere im einfachen Scherfluss. Zusätzlich zu den gestreckten Filamenten kann teilweise auch eine Taumelbewegung beobachtet werden, bei der ein Ende eines Filaments das andere überholt. Die Krümmungsradien der gebogenen Filamente während des Taumelns nehmen mit ansteigenden Geschwindigkeiten ab. Unter Verwendung des Kräftegleichgewichts von Reibungs- und Biegekräften wird ein Skalengesetz hergeleitet, mit welchem die experimentellen Werte äußerst gut beschrieben werden können. Gebogene Filamente werden zusätzlich auch in der Kanalmitte beobachtet, deren relativ stabile Formen durch Parabeln beschrieben werden können. Der Grund für die Verbiegung dieser Filamente ist das nicht-monotone, parabolische Flussprofil. Die parabelförmigen Konturen können mit einem Model eines elastischen Stabes beschrieben werden. Zusätzlich zu den Konformationen und Orientierungen der Filamente im Fluss wird die Häufigkeitsverteilung der Filamente an verschiedenen Kanalpositionen entlang eines Querschnittes analysiert. Wahrscheinlichkeitsverteilungen des Schwerpunktes zeigen, dass die Filamente nicht gleichmäßig über die ganze Kanalbreite verteilt sind. In Nähe der Wände existieren deutliche Verarmungszonen. Bei hohen Flussgeschwindigkeiten bildet sich zusätzlich eine starke Verarmungszone in der Kanalmitte aus. Eine Verringerung der Filamentdiffusivität hin zur Wand ist aufgrund der ansteigenden Scherrate vorhanden. Dies führt zu einer Bewegung der Filamente weg von der Kanalmitte. In Nähe der Wände lassen sich die Verarmungszonen durch sterische und hydrodynamische Wechselwirkungen mit den Wänden erklären. Die ortsabhängige Diffusivität der Filamente kann bestimmt werden indem eine Proportionalität zwischen Diffusivität und mittlerer quadratischer Abweichung der Filamentsegmente von der Stromlinie des Filamentsschwerpunktes angenommen wird. Unter Verwendung dieser Diffusivität können die Wahrscheinlichkeitsverteilungen des Schwerpunktes bei verschiedenen Geschwindigkeiten berechnet werden. Die berechneten und experimentellen Verteilungen zeigen die gleichen grundlegenden Merkmale wie Verarmungszonen an den Wänden und in der Kanalmitte.Im zweiten Teil der Arbeit wird die Bildung von Bündeln bestehend aus Aktinfilamenten unter Zugabe bündelbildender Proteine oder mehrwertiger Ionen diskutiert. Mit Methoden der Mikrofluidik basierend auf hydrodynamische Fokussierung wird die Bündelung zeitaufgelöst auf molekularer Skala fluoreszensmikroskopisch abgebildet. Ausgehend von einzelnen Filamenten wird die Bildung der Bündel und deren Anwachsen analysiert. Aus der Intensität des Fluoreszenssignals kann dabei die Anzahl der Filamente innerhalb eines Bündels bestimmt werden. Die Auswertung zeigt, dass die Bündlung von Aktinfilamenten ein diffusionslimitierter Prozess ist. Durch Analyse der thermischen Fluktuationen der Bündel lassen sich auch ihre mechanischen Eigenschaften bestimmen. Die Abhängigkeit der gemessenen Persistenzlänge von der Anzahl der Filamente innerhalb eines Bündels weißt auf eine schwache Kopplung der Filamente untereinander hin. Diese Kopplung resultiert vermutlich aus einer Optimierung der Ladungsverteilung innerhalb der Bündel.
Schlagwörter: Aktin; semiflexible Polymere; Mikrofluidik; Bündelbildung