Tuning DNA Compaction
DNA-Kompaktion
by Rolf Dootz
Date of Examination:2008-02-19
Date of issue:2008-08-13
Advisor:Dr. Thomas Pfohl
Referee:Prof. Dr. Tim Salditt
Referee:Prof. Dr. Stephan Herminghaus
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Size:9.07Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
DNA compaction is the collapse of long DNA chains into well-organized condensates of complex, hierarchical nanostructure induced by the presence of cationic agents. Although much progress has been made in understanding underlying interaction mechanisms of in vivo DNA compaction, the interplay of the myriad compaction agents and their types of interactions with DNA still raise a wealth of unanswered, fundamental questions. In particular, the hierarchical organization of chromatin is widely unclear. There, the DNA is first wrapped around histone cores and the formed beads-on-a-string structure is successively shifted towards higher order forms of chromatin structure. The latter process involves linker histones as major antagonists.Here, new results are presented that are derived from bio-mimetic investigations of the simplest possible DNA compaction model system containing only dendrimers, which can be viewed as uniformly charged cationic nanospheres, and unspecific, polydisperse DNA. Small angle X-ray (micro-)diffraction is employed as a principle method of analysis that accesses relevant molecular length scales. Targeting a quantitative understanding of compaction mechanisms, X-ray (micro-)diffraction measurements performed under laminar flow conditions in hydrodynamic focusing microfluidic devices provides microscale control of the self-assembly process. In addition, the method enables time-resolved access to structure formation in situ, in particular to transient intermediate states.Utilizing the high level of control over dendrimer size and charge, DNA compaction is systematically tuned and analyzed in detail. Results show that dendrimers bridge the entire spectrum of biological condensation agents from small cations, such as spermine/spermidine encountered in viruses, to the much larger histone proteins found in eukaryotic cells. Despite its simplicity, the dendrimer/DNA system reproduces characteristic features of DNA compaction in vivo. In particular, PAMAM 6 dendrimers (having a size and charge comparable to histone core proteins) induce a complete wrapping of the DNA around the cation. As such, PAMAM 6/DNA entities are structurally artificial equivalents of nucleosome core particles. For cationic dendrimers having an intermediate size and charge, which is conveniently between that of small multivalent organic cations and larger histone-like proteins, an alternate route of DNA compaction aside from the established salt or macroion condensation is observed in microflow below the isoelectric point, where DNA is in excess of dendrimers.In addition, the phenomenon of charge-induced dendrimer swelling has been experimentally quantified in detail over a wide range of generations. Results clearly show highly predictable, charge-induced changes of the dendrimer conformation and therefore eliminate the discrepancy between theory and experiments that previously existed in literature.Besides artificial model-proteins, the interaction of linker histones H1 and DNA has been studied in microflow. The time-resolved access to struture formation dynamics clearly shows that the interaction of H1 with DNA is a two step process: an initial unspecific binding of H1 to DNA is followed by a rearrangement of molecules in the formed complexes. Results suggest that the conformational transition of H1 tails from their rather extended conformation, in aqueous solution, to their fully folded state, upon interaction with DNA, is most likely the motor of the conformational phase transition of H1/DNA assemblies.Results obtained in this thesis are expected to have a direct bearing on the understanding of the hierarchical organization of chromatin in vivo. Underlying concepts and techniques may be generalized and used to experimentally address also other relevant protein/DNA systems. Moreover, the studied systems are of inherent importance to the field of biotechnology and are expected to contribute towards the design of new vectors for DNA gene delivery.
Keywords: DNA; DNA compaction; histones; linker-histones; H1; dendrimers; PAMAM; PPI; microfluidics; microdevice; SAXS; X-ray; Raman
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DNA-Kompaktion bezeichnet die Kondensation von langen DNA-Molekülen zu extrem dicht gepackten Aggregaten mit komplexer Nanostruktur. Induziert wird dieser Vorgang im Allgemeinen durch kationische Wechselwirkungspartner. Trotz der bereits erzielten großen Fortschritte auf dem Weg zu einem vollständigen Verständnis der zugrundeliegenden Wechselwirkungsmechanismen stellt das komplexe Wechselspiel der zahlreichen beteiligten Reaktionspartnern Wissenschafter noch immer vor eine Vielzahl unbeantworteter Fragen. Insbesondere der hierarchische Aufbau des Chromatins, bei dem die DNA zunächst auf Histon-Oktamere aufwickelt und anschließend unter Beteiligung von Linker-Histonen zu höheren Organisationsstufen überführt wird, ist weitgehend ungeklärt.In der vorliegenden Arbeit werden biomimetische Untersuchungen des denkbar einfachsten Modellsystems für die DNA-Kompaktion vorgestellt. Dieses besteht nur aus Dendrimeren, die als gleichmäßig geladene, bis zu 10nm große, kationische Kugeln beschrieben werden können, und polydispersen DNA-Molekülen mit einer unspezifischen Basensequenz. Zur Untersuchung werden Röntgen-Diffraktionsmessungen eingesetzt. Die Durchführung der Messungen im kontinuierlichen Fluss in Mikrofluidik-Bauteilen unter Ausnutzung hydrodynamischer Fokussierungseffekte gewährt einen kontrollierten und zeitaufgelösten Zugang zu verschiedenen Stadien des Selbstorganisationsprozesses. Dadurch können insbesondere transiente Zwischenstadien der Reaktion verfolgt und ein quantitatives Verständnis der Kompaktionsmechanismen erzielt werden. Der hohe Grad der Kontrolle über die Größe und die Ladung der Dendrimere ermöglicht es, verschiedene DNA-Kompaktionsszenarien gezielt einzustellen und im Detail zu analysieren.Die Vielfalt der natürlich vorkommenden DNA-Kompaktionspartnern reicht von kleinen organischen Kationen wie Spermidin und Spermin in Viren bis hin zu den wesentlich größeren Histon-Oktameren in eukaryotischen Zellen. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass sich Dendrimere ausgesprochen gut dazu eignen, dieses gesamte Spektrum zu reproduzieren. Trotz seiner starken Vereinfachung ist das Dendrimer/DNA-Modellsystem in der Lage, charakteristische Züge der natürlich auftretenden DNA-Kompaktion wiederzugeben. Besonders hervorzuheben ist dabei die Wechselwirkung von DNA mit PAMAM 6-Dendrimeren, die zu einem Aufwickeln der DNA um die in Bezug auf Ladung und Größe mit Histon-Oktameren vergleichbaren PAMAM 6 führt. Die gebildeten PAMAM 6/DNA-Einheiten zeigen eine erstaunliche Übereinstimmung in Größe und Gestalt mit nukleosomalen Kernpartikeln. Für Dendrimere mit einer mittleren Größe von ca. 3nm kann unter Verwendung von mikrofluidischen Methoden ein neuartiger DNA-Kompaktionsmechanismus unterhalb des isoelektrischen Punktes beobachtet werden. Dieser unterscheidet sich grundlegend von den bereits bekannten Salz- oder Makroion-induzierten DNA-Kondensationsformen.Neben den Untersuchungen zur DNA-Kompaktion ist die Abhängigkeit der Dendrimerkonformation von der Ladung der Moleküle experimentell genau quantifiziert worden. Dabei sind vorhersagbare, ladungsabhängige Änderungen der Dendrimerkonformation beobachtet worden. Diese Beobachtungen beseitigen die Diskrepanz, die bisher in der Literatur zwischen theoretischen Vorhersagen und experimentellen Beobachtungen bestand.Zusätzlich zu den künstlichen Modell-Proteinen wurde auch die Wechselwirkung von natürlich vorkommenden Linker-Histonen H1 mit DNA im Mikrofluss zeitaufgelöst untersucht. Die aufgezeichnete Röntgen-Streubilder belegen einen zweistufigen Wechselwirkungsmechanismus: Auf ein zunächst unspezifisches Anlagern der Proteine an die DNS folgt eine Reorganisation der Moleküle im gebildeten Komplex. Die erzielten Ergebnisse legen nahe, dass eine durch die DNA induzierte vollständige Faltung der endständigen H1-Proteinketten für den beobachteten Phasenübergang der H1/DNA-Komplexe verantwortlich ist.Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse leisten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des hierarchischen Aufbaus von Chromatin. Es ist davon auszugehen, dass die zugrundeliegenden Konzepte einen experimentellen Zugang zu weiteren relevanten Protein/DNA-Systeme gewähren werden. Darüber hinaus besitzen die hier untersuchten Systeme biotechnologische Bedeutung und es wird erwartet, dass sie zur Entwicklung zukünftiger Transfektionsvektoren beitragen werden.
Schlagwörter: DNA; DNA-Kompaktion; Histone; Linker-Histone; H1; Dendrimere; PAMAM; PPI; Mikrofluidik; SAXS; Röntgen; Röntgenkleinwinkelstreuung; Raman