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New Methods in NMR Spectroscopy for the Study of Protein Dynamics

dc.contributor.advisorGriesinger, Christian Prof. Dr.de
dc.contributor.authorLakomek, Nils-Alexanderde
dc.date.accessioned2009-01-21T15:30:36Zde
dc.date.accessioned2013-01-18T13:43:40Zde
dc.date.available2013-01-30T23:51:14Zde
dc.date.issued2009-01-21de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B47D-0de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-2960
dc.description.abstractWesentlicher Inhalt dieser Doktorarbeit ist die Untersuchung der inneren Dynamik von Proteinen in einem Zeitfenster langsamer als die rotatorische Korrelationszeit tau_c (im Bereich von wenigen Nanosekunden) und schneller als ca. 50 Mikrosekunden (Supra-tau_c- Zeitfenster). Dieser Zeitbereich ist für Relaxationsmethoden der kernmagnetischen Resonanz (NMR) nicht zugänglich. Für die Funktion wichtige Proteindynamik in diesem Zeitbereich blieb daher bislang unerforscht. Mit Hilfe von Residualen Dipolaren Kopplungen (RDCs) in der NMR-Spektroskopie konnte dieser bislang verborgene Zeitbereich zugänglich gemacht werden. Als Modellsystem wurde Ubiquitin verwendet, ein 8.5 kDa großes Protein, das in viele regulatorische Prozesse in der Zelle involviert ist, z.B. im Abbauprozess von Proteinen.Während dieser Doktorarbeit wurde die experimentelle Basis der RDCs von NH Amidgruppen im Proteinrückgrat deutlich ausgebaut. Die experimentellen Grundlagen basieren nun auf NH RDC Datensätzen von Präzisionsmessungen in insgesamt 36 verschiedenen Orientierungsmedien. Das ist die breiteste und homogenste zur Zeit verfügbare Datensammlung. Aus den RDCs kann mit Hilfe der sogenannten RDC-basierten Modell-freien Analyse Information über Proteindynamik extrahiert werden. Dieses Analyseverfahren wurde ursprünglich von Griesinger und Mitarbeitern entwickelt und basiert auf der Messung von fünf linear unabhängigen Orientierungstensoren in mindestens fünf verschiedenen Orientierungsmedien. Unter Zuhilfenahme einer hochaufgelösten Struktur zur Berechnung der Orientierungstensoren zu den dazugehörigen RDC Datensätzen, kann damit strukturelle und dynamische Information abgeleitet werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die RDC-basierte Modell-freie Analyse mathematisch rigoros reevaluiert und der Algorithmus erheblich optimiert, z.B. im Hinblick auf die Ausfilterung experimentellen Rauschens. Mit Hilfe des neuen Analyse -Verfahrens konnten RDC-basierte Ordnungsparameter S2rdc(NH) mit bislang unerreichter Genauigkeit bestimmt werden. Diese S2rdc(NH) Ordnungsparameter machen neue, bislang unentdeckte Bewegungsmodi von Ubiquitin im Supra-tau_c-Zeitbereich sichtbar. Geladene und polare Aminosäuren zeigen eine höhere Beweglichkeit der Amidgruppen als Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten. Den Ergebnissen unserer Analyse zufolge liegt eine Korrelation zwischen Seitenketten-Orientierung und der Beweglichkeit des Proteinrückgrates vor. Aminosäuren mit Seitenketten, die der Lösung zugewandt sind, erscheinen im Proteinrückgrat beweglicher als Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten. Diese Beobachtung zeigte sich als alternierendes Muster von S2rdc(NH) Ordnungsparametern im beta-Faltblatt und stellte das bisherige Bild eines verhältnismäßig starren Proteinrückgrates in Frage, das nicht an die Dynamik der Seitenketten gekoppelt ist.Um von der Genauigkeit des Strukturmodells, das bei der Berechnung des Orientierungstensors benutzt wird, unabhängig zu werden, wurde die Selbst-Consistente RDC-basierte Model-freie Analyse (SCRM) entwickelt. Dieses Verfahren liefert RDC-basierte Ordnungsparameter und dynamisch gemittelte NH-Vektor-Orientierungen, unabhängig von den Details der Struktur, die zur Berechnung des Orientierungstensors herangezogen wird. Das SCRM-Verfahren untermauert das Vorhandensein von Bewegung langsamer als die Korrelationszeit tau_c. Der Einschluss des Supra-tau_c-Zeitbereichs vergrößert die mittlere Amplitude der Bewegung gegenüber dem Sub-tau_c-Zeitbereich um 34%.Im weiteren konnte ein RDC-basiertes Struktur-Ensemble von Ubiquitin entwickelt werden. Im Gegensatz zu bisherigen Ensembles, die auf Relaxationsdaten basieren und damit nur Bewegung schneller als die Korrelationszeit tau_c berücksichtigen, schliesst das RDC-basierte Struktur-Ensemble auch Dynamik im Mikrosekunden Bereich mit ein. Dieses neu entwickelte Ensemble deckt die gesamte strukturelle Heterogenität von Ubiquitin ab, die in verschiedenen Kristallstrukturen von Ubiquitin beobachtet wird, wenn dieses im Komplex an andere Proteine gebunden ist. Daraus schliessen wir, dass die molekulare Erkennung durch Ubiquitin über Konformations-Selektion erfolgt. Demzufolge liegen alle Konformationen von Ubiquitin schon in freier Lösung vor und werden nicht erst durch den Bindungspartner induziert.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nd/2.0/de/de
dc.titleNew Methods in NMR Spectroscopy for the Study of Protein Dynamicsde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedNeue Methoden in der NMR-Spektroskopie zur Untersuchung der Dynamik von Proteinende
dc.contributor.refereeKree, Reiner Prof. Dr.de
dc.date.examination2008-10-28de
dc.subject.dnb530 Physikde
dc.description.abstractengThe focus of this work has been the investigation of internal protein dynamics in a time window between the overall tumbling correlation time tau_c (a few nanoseconds) and about 50 microseconds (supra-tau_c time window). This time window is inaccessible by NMR relaxation methods, but contains functionally important dynamics which have remained undetected so far. With the use of Residual Dipolar Couplings (RDCs) in NMR spectroscopy this previously hidden time window is made accessible.We used ubiquitin as a model-system, a 8.5 kDa protein involved in many regulatory processes in the cell, such as protein degradation. During this PhD work the experimental basis of backbone amide group NH RDCs has been significantly enhanced. The experimental basis, consisting of NH RDC data sets from altogether 36 different alignment conditions is the broadest available and is of highest accuracy and homogeneity. From the RDC data, dynamic information can be extracted using the RDC-based model-free approach, originally invented by Griesinger and co-workers. The RDC-based model-free approach relies on the measurement of NH RDCs for five linearly independent alignment tensor orientations in at least five different alignment media. Using a high-resolution structure to determine the alignment tensors, structural as well as dynamic information can be deduced. During this PhD work the RDC-based model-free approach was rigorously re-evaluated mathematically and the algorithm further improved, for example, with respect to filtering out of experimental noise. Using this new approach, RDC-based order parameters S2rdc(NH) were derived with unprecedented accuracy revealing new modes of motion in the supra-tau_c time window. Charged and polar residues show more mobile backbone amide groups than hydrophobic residues. To our surprise, according to the RDC-based model-free analysis, a correlation between side-chain orientation and backbone mobility could be observed for ubiquitin. Residues with solvent-exposed side chains showed a tendency to be more mobile in the protein backbone, whereas those with side chains pointing towards the hydrophobic core appeared more rigid in the protein backbone. This finding was manifested as an alternating pattern of S2rdc(NH) order parameters in the beta-strands and challenges the current picture of a rigid protein backbone uncoupled to side-chain dynamics.In order to become independent from the accuracy of the structural model used for alignment tensor calculation, a Self-Consistent RDC-based Model-free analysis (SCRM) was developed. It delivers RDC-based order parameters independently of the details of the structure used for alignment tensor calculation, as well as the dynamic average orientation of the inter-nuclear vectors in the protein structure in a self-consistent manner. The SCRM approach corroborated the presence of motions slower than the correlation time tau_c. Indeed, the inclusion of the supra-tau_c window increases the averaged amplitude of mobility observed in the sub-tau_c window by about 34%.Furthermore, a RDC-refined structural ensemble of ubiquitin was derived. In contrast to relaxation-based ensembles of solution structures considering only motions faster than tau_c, the RDC-derived ensemble includes solution dynamics up to microseconds. The ensemble covers the complete structural heterogeneity observed in 46 ubiquitin crystal structures, most of which are in complexes with other proteins. From that we conclude that conformational selection, rather than induced fit motion suffices to explain the molecular recognition dynamics of ubiquitin.de
dc.contributor.coRefereeGriesinger, Christian Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerKernspinresonanzde
dc.subject.gerUbiquitinde
dc.subject.gerProteindynamikde
dc.subject.gerdipolare Kopplungende
dc.subject.engNMRde
dc.subject.engubiquitinde
dc.subject.engprotein dynamicsde
dc.subject.engRDCde
dc.subject.bk33.07de
dc.subject.bk35.25de
dc.subject.bk35.62de
dc.subject.bk42.12de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2007-3de
dc.identifier.purlwebdoc-2007de
dc.affiliation.instituteFakultät für Physikde
dc.subject.gokfullRRA 300: Kernmagnetische Resonanz NMR- {Physik: Hochfrequenzspektroskopie}de
dc.identifier.ppn61789681Xde


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