Markierungsfreie Proteinanalytik mit oberflächenverstärkter Ramanspektroskopie
Label-free protein analytics with surface-enhanced Raman spectroscopy
by Konstantin Christou
Date of Examination:2009-08-25
Date of issue:2009-12-15
Advisor:Dr. Volker Beushausen
Referee:Prof. Dr. Gerd Marowsky
Referee:Prof. Dr. Werner Lauterborn
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The determination of biological functions of proteins in metabolism is an important discipline in the field of life sciences. The search for marker proteins, correlated directly to pathological changes in metabolism, plays an important role. Therefore, different multidisciplinary methods for the qualitative and quantitative detection are combined, offering a comprehensive characterisation of a protein or even of protein compositions. The applied methods are usually dependent on tedious and cost-intensive labeling of the proteins. In this work, the potential and limits of Raman spectroscopy, with the focus on surface-enhanced Raman spectroscopy, as a direct non-invasive and optical method for detection in protein analytics will be evaluated. The development and construction of a Raman spectrometer, which offers high light-throughput and therefore a high detection sensitivity, is fundamental for the studies. The detection sensitivity is discussed by concentration-dependent measurements of proteins. To increase the detection sensitivity, capillaries made of Teflon-AF are used. In a detailled study capillary length and internal capillary diameter as well as the reflection coefficient of the capillaries are varied to point out the best configuration for a maximum signal strength. The results indicate that a further increase of the detection sensitivity is necessary. For this reason, surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) is used and different nanostructured surfaces of noble metals, suitable for SERS, are fabricated. The enhancement factor as well as the signal reproducibility of these substrates are determined by self-assembled monolayers of benzenethiol. Imaging technologies, such as atomic force and electron microscopy, are used to get detailled information of the topography of the nanostructures which are correlated with the measured Raman intensities. Based on these results concentration-dependent surface-enhanced Raman measurements of the proteins albumin, insulin and lysozyme are presented. Meas urements in the femtomol range are performed. The identification of proteins is achieved by a combination of multivariate principal component analysis and spectrum pre-processing.
Keywords: Surface-enhanced Raman spectroscopy; nanostructuring; surface morphology; proteins; detection sensitivity; multivariate analysis
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Die Aufklärung der biologischen Funktion von Proteinen im Metabolismus ist eine der bedeutsamsten Disziplinen im Bereich der Lebenswissenschaften. Dabei spielt die Suche nach Markerproteinen, die direkt mit einer krankhaften Veränderung im Metabolismus korrelieren, eine zentrale Rolle. Dafür werden unterschiedlichste interdisziplinäre Methoden zum qualitativen und quantitativen Nachweis kombiniert, die eine umfassende Charakterisierung eines Proteins oder Proteingemisches ermöglichen. Diese Nachweisverfahren sind in der Regel auf eine aufwendige und kostenintensive Markierung der Proteine auf molekularer Ebene angewiesen. In dieser Arbeit werden die Möglichkeiten und Grenzen der Ramanspektroskopie mit Schwerpunkt auf der oberflächenverstärkten Ramanspektroskopie als direktes, markierungsfreies und optisches Nachweisverfahren für die Proteinanalytik evaluiert. Grundlage für die Durchführbarkeit der Untersuchungen an Proteinen ist die Entwicklung und Konstruktion eines hochsensitiven Ramanspektrometers, das speziell auf hohen Lichtdurchsatz und damit auf hohe Nachweisempfindlichkeit optimiert wird. Die Nachweisempfindlichkeit wird am Beispiel von Konzentrationsmessungen an Proteinen diskutiert. Zur Steigerung der Nachweisempfindlichkeit werden Kapillaren aus Teflon-AF eingesetzt und detaillierte Untersuchungen der Parameter Kapillarlänge und Kapillardurchmesser sowie der Reflektionskoeffizient in Hinblick auf maximale Ramanstreulichtausbeute der verwendeten Proteine vorgenommen. Bei diesen Untersuchungen zeichnet sich ab, dass eine weitere Steigerung der Nachweisempfindlichkeit notwendig ist, die in dieser Arbeit mit Hilfe der oberflächenverstärkten Ramanspektroskopie realisiert wird. Dazu werden unterschiedliche Strategien für die Herstellung nanostrukturierter ramanstreulichtverstärkender Edelmetalloberflächen verfolgt. Verstärkungsfaktor und Signalreproduzierbarkeit werden mit Hilfe selbstorganisierender Thiophenol-Monolagen umfassend untersucht. Bildgebende Messverfahren wie die Rasterkraft- und Elektronen mikroskopie liefern darüber hinaus detaillierte Informationen über die Topographien der erzeugten Nanostrukturen, die mit den Signalausbeuten korreliert werden. Basierend auf diesen Ergebnissen werden Konzentrationsmessungen der Proteine Albumin, Insulin und Lysozym im Femtomol-Bereich auf einer der charakterisierten nanostrukturierten Oberfläche vorgestellt. Mit Hilfe der multivariaten Hauptkomponentenanalyse wird eine eindeutige Identifizierung der Proteine im Femtomol-Konzentrationsbereich demonstriert und die entsprechende Spektrenvorbehandlung diskutiert.
Schlagwörter: Oberflächenverstärkte Ramanspektroskopie; Nanostrukturierung; Oberflächenmorphologie; Proteine; Nachweisempfindlichkeit; multivariate Analyse