Fast STED Microscopy

Abstract

Die räumliche Auflösung optischer Fernfeldmikroskope war durch Beugung begrenzt, bis STED-Mikroskopie das Beugungslimit durchbrach. Diese Doktorarbeit kombiniert zum ersten Mal die hohe räumliche Auflösung dieser Technik mit hoher zeitlicher Auflösung zur Schnellen (strahlabtastenden) STED-Mikroskopie. Sie läutet die Untersuchung schneller dynamischer Prozesse durch STED-Mikroskopie ein: Nicht-beugungsbegrenzte Filme mit 200 Bildern pro Sekunde werden von Kolloiden aufgenommen, lebende Zellen werden mit Videorate gefilmt. Insbesondere werden die Diffusion von 36 nm-Kügelchen mit 80 Bildern pro Sekunde und die Prozesse an der Wachstumsfront eines Kolloidkristalls mit 200 Bildern pro Sekunde gezeigt. Biologische Proben werden nicht nur um des Mikroskopieprinzips willen, sondern mit einer aktuellen biologischen Fragestellung gefilmt und analysiert: Es wird demonstriert, daß die Bewegung von Neurotransmittervesikeln Zustände hoher und niedriger Mobilität beinhaltet. Die Verwendung von gepulsten Lasern für die Schnelle STED-Mikroskopie lebender Neuronen wird mit derjenigen von Dauerstrichlasern verglichen. Methoden für die quantitative Analyse der Filme, insbesondere zur Lokalisierung und Verfolgung von Vesikeln, werden entwickelt. Diese Methoden werden erweitert, um die Korrelation der Stoffwechselrate von Zellen mit der Dichte der Translokase der äußeren Membran in Mitochondrien zu zeigen. Die strahlabtastende STED-Mikroskopie wird auf Zweifarbenaufnahmen ausgedehnt. Damit werden Proteininteraktionen in menschlichen Stammzellen untersucht; dies führt die optische hochauflösende Bildgebung auch in die medizinische Forschung ein. Die Kolokalisierung der Proteine CD63, TIMP-1 und .Beta1-Integrin wird nachgewiesen. Diese Doktorarbeit enthält auch einen historischen Abriß der Erkenntnisse zur Beugungsbegrenzung und diskutiert den Einfluß von Rauschen und Pixeln auf die Auflösung.