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The role of protein phosphorylation in regulation of carbon catabolite repression in Bacillus subtilis

dc.contributor.advisorGörke, Boris Dr.de
dc.contributor.authorSingh, Kalpanade
dc.date.accessioned2008-11-20T06:52:33Zde
dc.date.accessioned2013-01-18T14:22:43Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:57Zde
dc.date.issued2008-11-20de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B4D2-0de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-3172
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-3172
dc.description.abstractCCR ist eines der bestuntersuchtesten Signaltransduktionssysteme in Bakterien. Es erlaubt Bakterien, sich an Veränderung im Vorhandensein von Kohlenstoffquellen anzupassen. Die CCR wird definiert als die Umsetzung der bevorzugten Kohlenstoffquelle, welche die Expression von Gene für die Umsetzung sekundärer Kohlenstoffquellen reprimiert. Auf der molekularen Ebene wird die CCR in B. subtilis durch den globalen Transkriptionsregulator CcpA erreicht. Wenn bevorzugte Kohlenstoffquellen wie Glukose vorhanden sind, bildet CcpA mit den phosphorylierten HPr- oder Crh- Proteinen einen Komplex. Dieser Komplex bindet an Operatorstellen der DNA, die als cre-Stellen bezeichnet werden. So werden viele Gene und Operons reprimiert, die an der Verwertung von sekundären Kohlenstoffquellen beteiligt sind. Die regulatorischen Phosphorylierungen von HPr und Crh wird durch das bifunktionale Enzym HPrK/P erreicht.In dieser Arbeit wurde die Wirkung von verschiedenen Kohlenstoffquellen auf die CCR untersucht. Für viele Kohlenstoffquellen konnte eine CcpA-abhängige Kataboliten-Repression im Reportersystem gezeigt werden. Des Weiteren konnte eine Hierarchie der Kohlenstoffquellen anhand ihres reprimierenden Potentials erstellt werden. Die verschiedenen Stärken der Repression durch die verschiedenen Kohlenstoffquellen könnten durch unterschiedliche Mengen des CcpA/Ko-Repressor-Komplexes erklärt werden. Die Mengen an CcpA und HPr ändern sich bei verschiedenen Kohlenstoffquellen nicht. Deshalb wurde das Phosphorylierungsmuster von HPr untersucht. Dazu konnte gezeigt werden, dass HPr aber nicht Crh für die Repression durch CcpA relevant ist. Deshalb wurde nur die Menge von HPr(Ser-P) in der Zelle untersucht. Stark reprimierende Kohlenstoffquellen führen zu einer hohen intrazellulären Konzentration von HPr(Ser-P). Die Särken der Katabolitenrepression lassen sich zurückführen auf die unterschiedliche Fähigkeit der Kohlenstoffquellen HPr(Ser-P) herzustellen.Bei Kohlenstoffquellen, die nur eine schwache Katabolitenrepression hervorrufen, konnten neben einer geringen Menge HPr(Ser-P) auch HPr-Proteine detektiert werden, die am Histidin phosphoryliert waren. HPr ist ebenfalls am PTS beteiligt. Das PTS kombiniert die Aufnahme von Kohlenstoffquellen mit deren Phosphorylierung. Im PTS wird das HPr-Protein durch EI am Histidinrest 15 phosphoryliert. Diese Phosphorylierung könnte die Menge an verfügbarem HPr als Substrat für die HPrK/P verringern. Deshalb wurde die Möglichkeit überprüft, ob HPr(His-P) die Phosphorylierung von HPr durch HPrK/P negativ reguliert. In einer EI-Mutante kann kein HPr(His-P) mehr gebildet werden. Trotzdem bleibt die Stärke der Katabolitenrepression in dieser Mutante bei nicht-PTS-Zuckern gleich. Daraus kann geschlossen werden, dass die Phosphorylierung von HPr am Ser46 allein durch die Aktivität von HPrK/P reguliert wird und unabhängig vom PTS ist. Die niedrigen Mengen HPr(Ser-P) bei Kohlenstoffquellen mit schwacher Katabolitenrepression resultieren aus einer geringen Kinaseaktivität der HPrK/P. Diese Hypothese wurde mit einer Mutante belegt, die eine HPrK/P-Mutation trägt, die dazu führt, dass das Enzym keine Phosphorylaseaktivität mehr besitzt. In dieser Mutante kommt es immer zur Katabolitenrepression.Es wird vermutet, dass die Aktivität der HPrK/P durch eine allosterische Regulation durch Metabolite wie FBP oder Pi erreicht wird. Deshalb wurde die FBP-Konzentration in vivo bestimmt. Mit dem meisten Zuckern ist der intrazelluläre FBP-Spiegel ausreichend hoch, um vollständige Kinaseaktivität der HPrK/P zu erreicht. Es müssen also weitere Faktoren vorhanden sein, die die Aktivität in vivo beeinflussen. Um zu überrpüfen, ob der HPr(Ser-P)-Pool durch andere Enzyme außer der HPrK/P beeinflußt wird, wurde die Rolle von PrpC untersucht. PrpC, eine Ser/Thr-Phosphatase, kann HPr(Ser-P) in M. pneumoniae dephosphorylieren. Das PrpC aus B. subtilis kann HPr(Ser-P) in vitro dephosphorylieren, aber es konnte kein Einfluß auf die Katabolitenrepression in vivo festgestellt werden.Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die HPrK/P eine zentrale Rolle bei der Katabolitenrepression in B. subtilis spielt. Die verschieden starken Effekte auf die Katabolitenrepression durch verschiedene Kohlenstoffquellen konnten durch einen unterschiedlichen HPr(Ser-P)-Spiegel erklärt werden. Außerdem konnte der fundamentale Unterschied im Mechanismus der Katabolitenrepression zwischen E. coli und B. subtilis weiter verdeutlicht werden. Die Aktivität des PTS ist in E. coli der ausschlaggebende Faktor für die globale sowie für die Operon-spezifische Katabolitenrepression. Ohne HPr(His-P) das EIIAglu aus E. coli unphosphoryliert und übt eine starkt Katabolitenrespression aus. In Gegensatz dazu wird die globale Katabolitenrepression in B. subtilis nicht direkt von der PTS-Aktivität beeinflußt.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nd/2.0/de/de
dc.titleThe role of protein phosphorylation in regulation of carbon catabolite repression in Bacillus subtilisde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedThe role of protein phosphorylation in regulation of carbon catabolite repression in Bacillus subtilisde
dc.contributor.refereeStülke, Jörg Prof. Dr.de
dc.date.examination2008-10-31de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaftende
dc.subject.dnbBiologiede
dc.description.abstractengCCR is one of the most thoroughly investigated signal transduction system in bacteria. It allows the bacteria to adapt to changes in the availability and supply of different carbon sources. In general, CCR is defined as the selective utilization of a preferred carbon source which represses the functions for the utilization of secondary carbon sources. At the molecular level, CCR is achieved by the global transcriptional regulator CcpA, in B. subtilis. CcpA forms a repressor complex with serine phosphorylated HPr and Crh proteins in the presence of a preferred carbon source like glucose. This repressor complex binds to the operator sites on the DNA called cre sites and thereby repressing a number of catabolic genes and operons involved in utilization of secondary carbon sources. The regulatory phosphorylation of HPr and Crh is achieved by a bifunctional enzyme HPrK/P.In this work, the repressing potential of various carbon sources besides glucose was analysed. A number of carbon sources could exert CcpA-mediated catabolite repression of the reporter system. Moreover, the substrates formed a hierarchy in their ability to exert repression. The different levels of repression by various carbon sources indicated the formation of the CcpA/co-repressor complex to different extents. CcpA and HPr levels were found to be similar in the cell, irrespective of the nature of the carbon source used. Thus, the phosphorylation pattern of the co-repressor was analysed. As a prerequisite for this experiment, it could be established that HPr and not Crh is the relevant co-repressor of CcpA. Thus, the focus was on analysing the level of HPr(Ser-P) in the cell. The presence of strong repressing carbon sources generated high intracellular HPr(Ser-P) as compared to the poor repressing carbon sources. Thus, it could be well established that the different repressing potential of various carbon sources is derived from the ability to generate different intracellular levels of HPr(Ser-P).In the presence of poor repressing carbon sources, besides low intracellular HPr(Ser-P), considerable amounts of histidine phosphorylated HPr were also present. HPr is also a part of the sugar PTS. The PTS is involved in the concomitant uptake and phosphorylation of various carbon sources. As a part of PTS, HPr is phosphorylated at its His-15 residue and receives phosphate from PEP via EI. Phosphorylation at histidine residue might decrease the available HPr as a substrate for HPrK/P. Therefore, the possibility that the presence of HPr(His-P) negatively regulates the phosphorylation of HPr by HPrK/P was addressed. In an EI mutant, HPr(His-P) is not formed. However, the repression potential of the non-PTS carbon sources remained unchanged in the EI mutant. This clearly established that the phosphorylation of HPr at Ser-46 is exclusively determined by HPrK/P activity and not by the PTS. Thus, in the presence of weaker repressing carbon sources, low HPr(Ser-P) levels are generated owing to the low kinase activity of HPrK/P. This hypothesis was confirmed by using an HPrK/P variant, which lost its phosphorylase activity. Such a variant exhibited a low but constitutive kinase activity and allowed repression even in the absence of a repressing carbon source.Modulation of the HPrK/P activity is suggested to be achieved by an allosteric regulation by metabolites like FBP and Pi. Therefore, we determined the FBP concentration in vivo. It turned out that on most sugars the intracellular FBP level is high enough to achieve theoretically a complete activation of the HPrK/P kinase activity. Therefore, further factors should exist that regulate HPrK/P activity in vivo. To probe into the possibility that HPr(Ser-P) levels can be affected by an enzyme other than HPrK/P, the role of PrpC was analysed. PrpC, a Ser/Thr phosphatase, has shown to dephosphorylate HPr(Ser-P) in M. pneumoniae. B. subtilis PrpC could dephosphorylate HPr(Ser-P) in vitro, but its absence or presence had no effect on CCR in vivo.Taken together, this work coherently demonstrates the central role of HPrK/P in CCR in B. subtilis. Moreover, the hierarchy of repression exerted by various carbon sources could be well explained with the levels of HPr(Ser-P) generated in the cell. This work further highlights the fundamental differences in the mechanism of catabolite repression in the two model organisms E. coli and B. subtilis. PTS transport activity is the decisive factor of both global and operon-specific CCR in E. coli. In the absence of HPr(His-P) in E. coli, EIIAglu is rendered unphosphorylated and exerts strong catabolite repression. In contrast, the global CCR mechanism in B. subtilis is not directly affected by the PTS activity.de
dc.contributor.coRefereeLiebl, Wolfgang Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeWahl, Markus Prof. Dr.de
dc.subject.topicMolecular Biology & Neurosciences Programde
dc.subject.gerBacillus subtilisde
dc.subject.gerPhosphorylationde
dc.subject.gerPTSde
dc.subject.gerHPrde
dc.subject.gerHPrK/Pde
dc.subject.gerCarbon catabolite repressionde
dc.subject.engBacillus subtilisde
dc.subject.engPhosphorylationde
dc.subject.engPTSde
dc.subject.engHPrde
dc.subject.engHPrK/Pde
dc.subject.engCarbon catabolite repressionde
dc.subject.bk42.30de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1949-9de
dc.identifier.purlwebdoc-1949de
dc.affiliation.instituteGöttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und molekulare Biowissenschaften (GGNB)de
dc.subject.gokfullWUK000de
dc.identifier.ppn614644658de


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