Glutamate-induced reversal of dopamine transport is mediated by the PKC signalling pathway
by Luis Felipe Opazo Dávila
Date of Examination:2008-04-30
Date of issue:2009-04-16
Advisor:Prof. Dr. Jörg B. Schulz
Referee:Prof. Dr. Mathias Bähr
Referee:Prof. Dr. Walter Stühmer
Referee:Prof. Dr. Diethelm Richter
Files in this item
Name:opazo.pdf
Size:10.9Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Dopaminergic neurons release their transmitter not only from axon terminals in the striatum but also from their long apical dendrites in the substantia nigra pars reticulata (SNr). Whether dendritic dopamine release is mediated by vesicle fusion or by the reversal of the dopamine transporter (DAT) remains controversial. Previous studies suggested that glutamate-induced dopamine release through the DAT was insensitive to ionotropic glutamate receptors inhibition. In this study we explored whether metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are involved in DAT-mediated dendritic dopamine release. We used amperometric recordings to directly measure dopamine release in midbrain rat brain slices. Glutamate induced DAT-mediated dopamine release and was reversibly blocked by chelerythrine, a protein kinase C (PKC) inhibitor. A selective mGluR group I agonist induced dopamine release and was reversibly blocked by the DAT antagonist GBR12935. Additionally, the PKC activator PMA was also capable to elicit a DAT-mediated dopamine efflux. PKC-enhanced dopamine release has recently been associated with the effect of amphetamine on the DAT, but not with the activation of physiological mGluRs. To further decipher the responsible cell signalling elements of the reversal of the DAT, we generated stably transfected SH-SY5Y cells expressing a human wild-type DAT (SH-DAT). All metabotropic downstream signalling elements were able to induce dopamine release and were blocked by chelerythrine. To evaluate if PKC acts directly on the DAT, we generated a new stably transfected cell line only expressing a truncated dopamine transporter (SH-D19). Five serines, that were possible phosphorylation sites, were removed by deleting the first 19 N-terminal amino acids of the DAT. However, PKC-induced dopamine release was not affected in SH-D19, when compared with SH-DAT. Interestingly, PKC-induced dopamine efflux in SH-DAT cells was blocked when the non-selective cation channel blocker, lanthanum (La+3) was present. Our findings suggest that PKC-induced dopamine release did not act by direct DAT phosphorylation. Instead, an influx of sodium is required downstream of PKC activation and could be mediated by PKC gated cation channels like the transient receptor potential (TRP) channels. Throughout this work, we demonstrate that the activation of a second messenger signalling cascade leads to a reversal of the DAT. Since metabotropic receptors are widely expressed in the nervous system, the new concept on PKC-mediated reversal transport, suggests that this phenomenon may also occur in other locations and with other neuroransmitters of the nervous system. Even more, this study suggests that the release of neurotransmitters is not limited to a presynaptic location.
Keywords: Basal ganglia; Substantia nigra; Dopamin; Dopamine Transporter; DAT; Amperometry
Other Languages
Dopaminerge Neuronen setzen ihre Transmitter nicht nur von den Axonterminals im Striatum frei, sondern auch von ihren langen apikalen Dendriten in der substantia nigra pars reticulata (SNr). Ob die dendritische Freisetzung von Dopamin durch Exozytose oder durch die Umkehrung des Dopamintransporters (DAT) geschieht, ist nach wie vor umstritten. Vorangehende Studien zeigten, dass die Glutamat-induzierte Freisetzung von Dopamin durch den DAT keine ionotropen Glutamatrezeptoren erfordert. In dieser Studie erforschten wir daher die Rolle von metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluRs) für der Freisetzung von dendritischem Dopamin durch den DAT. Wir benutzten Amperometrie, um die Freisetzung von Dopamin in Gehirnschnitten aus dem Mittelhirn von Ratten zu messen. Glutamat induzierte die Freisetzung von Dopamin durch den DAT und wurde reversibel durch Chelerythrin, einen Inhibitor der Proteinkinase C (PKC), blockiert. Ein selektiver Gruppe I mGluR-Agonist induzierte die Freisetzung von Dopamin und wurde reversibel durch den DAT-Antagonisten GBR12935 blockiert. Ferner war der PKC-Aktivator PMA ebenfalls in der Lage, eine DAT-vermittelte Freisetzung von Dopamin hervorzurufen. Die PKC-induzierte Freisetzung von Dopamin war bisher mit dem Effekt von Amphetamin auf den DAT in Verbindung gebracht worden, jedoch nicht mit der physiologischen Aktivierung von mGluRs. Um die Elemente der Signalkaskade in der Zelle weiter zu untersuchen, erzeugten wir stabil transfizierte SH-SY5Y Zellen, die humanen DAT (SH-DAT) exprimieren. Elemente der mGluRI Signalkaskade waren in der Lage, die Freisetzung von Dopamin zu induzieren und wurden durch Chelerythrin blockiert. Um die Rolle N-terminaler Phosphorylierung des DAT für die hier untersuchte Freisetzung von Dopamin zu untersuchen, generierten wir eine neue stabil transfizierte Zelllinie, die einen um die ersten 19 Aminosäuren gekürzten Dopamintransporter (SH-D19) exprimierte. Fünf N-terminale Serine, die mögliche PKC-Phosphorylierungsstellen sind, wurden dadurch entfernt. Jedoch war die PKC-induzierte Freilassung von Dopamin in diesen SH-D19 Zellen weiterhin möglich. Der PKC-induzierte Dopaminausfluss in den SH-DAT Zellen wurde dagegen durch den nicht-selektive Kationenkanalblocker Lanthanum (La+3) blockiert. Unsere Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass PKC-induzierte Dopaminfreisetzung nicht durch DAT-Phosphorylierung auftritt. Stattdessen wird möglcherweise ein Natriumeinstrom nach der PKC-Aktivierung benötigt. Dieser könnte durch PKC-abhänige Kationskanäle, wie die transient receptor potential (TRP) Kanäle, vermittelt werden. In dieser Arbeit zeigen wir, dass die Aktivierung einer Signalkaskade zu einer Umkehrung des DAT führt. Da metabotrope Rezeptoren im Nervensystem weithin exprimiert sind, könnte dieses Phänomen auch an anderen Stellen und mit anderen Neurotransmittern auftreten. Darüberhinaus weist diese Studie darauf hin, dass die Freisetzung von Neurotransmittern nicht auf einen presynaptischen Ort limitiert ist.
Schlagwörter: Basal ganglia; Substantia nigra; Dopamin; Dopamine Transporter; DAT; Amperometry