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Molecular dynamics of clathrin proteins at endocytic sites studied with evanescent-wave microscopy

Untersuchung der molekularen Dynamik von Clathrin mit Totalreflektionsmikroskopie

by Dinah Loerke
Doctoral thesis
Date of Examination:2004-02-12
Date of issue:2004-10-04
Advisor:Prof. Dr. Erwin Neher
Referee:Prof. Dr. Annette Zippelius
Referee:Prof. Dr. Werner Lauterborn
Referee:Prof. Dr. Franz Kneer
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-2893

 

 

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Name:loerke.pdf
Size:2.57Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

Clathrin (consisting of a light chain and a heavy chain subunit) is a triskelion-shaped molecule that self-assembles into polyhedral lattices on cellular membranes. It has a pivotal role in membrane transport inside the cell, as the curvature of the clathrin lattice can be increased to form a clathrin "pit", which serves to progressively invaginate the attached patch of membrane to form a small membrane sphere (called vesicle), which is then pinched off from the membrane. To study the cellular regulation of the self-assembly of clathrin pits, the binding/unbinding kinetics of fluorescent fusion constructs of the two clathrin subunits were investigated using evanescent-wave (EW) microscopy in conjunction with photobleaching recovery.EW microscopy makes use of the evanescent wave created by total internal reflection of a laser beam (at the dielectric interface between a glass coverslip and a specimen in aqueous medium) for fluorescence excitation. Through the exponential decay of the evanescent field, fluorescence excitation is restricted to a thin layer on top of the interface (with a thickness on the order of magnitude of the light wavelength); thus, the technique is ideally suited to study cellular processes in the vicinity of the membrane. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) is used to estimate the speed of unbinding of fluorescent clathrin molecules from single clathrin pits (as the time constant of exponential reaction recovery constitutes the unbinding time constant 1/koff). Since the reaction signal is partly masked by the diffusion of cytosolic fluorophores, one important aim of this work was to separate reaction and diffusion signals to permit a quantitative estimation of unbinding kinetics.At room temperature, the unbinding time constant of clathrin light chain was estimated to be τ=18.9±1.3s. Light chain exchange from pits is blocked by sucrose treatment, by calcium depeletion or ATP depletion of the cell. For clathrin heavy chain, it was found that the unbinding time constant is faster than for light chain. Additionally, the treatments which completely inhibit clathrin light chain exchange from pits do not abolish heavy chain recovery. It is concluded that for heavy chain, a light-chain independent exchange pathway with a faster time constant exists, which is isolated through calcium and ATP depletion, and its time constant is estimated to be 10.0±0.9s. The ontributions of the different pathways are modulated by selective overexpression of the clathrin subunits.It can be concluded that clathrin light chain, in turn, therefore has a role in stabilising heavy chain molecules bound in pits, as well as in modulating clathrin function in vivo in a calcium- and ATP-dependent manner.
Keywords: clathrin; light chain; heavy chain; FRAP; photobleaching; exchange; evanescent; fluorescence microscopy

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Das Protein Clathrin bildet dreizackförmige Moleküle (Triskelia), die aus je drei light chain- und drei heavy chain-Untereinheiten bestehen. Die Triskelia bauen sich im Zellinneren auf der Oberfläche von Membranen selbständig zu flachen sechseckigen oder zu gewölbten fünfeckigen Gittern zusammen. Clathrin spielt insbesondere für den intrazellulären Transport eine wichtige Rolle; in clathrin pits werden durch steigenden Krümmungsradius des Clathringitters kleine bläschenförmige Einstülpungen der Zellmembran gebildet - Transportvesikel - die anschließend abgeschnürt und ins Zellinnere transportiert werden. Gegenstand dieses Projekts war die Frage, wie die Zelle den selbständigen Aufbau von Clathringittern reguliert. Hierfür wurde mit Totalreflektionsmikroskopie die Kinetik des Austausches von fluoreszenten Konstrukten der beiden Clathrin-Untereinheiten untersucht.Bei der Totalreflektion eines Laserstrahls an einer dielektrischen Grenzfläche, z.B. zwischen Glas und einer Zelle in wässrigem Medium, entsteht im optisch dünneren Medium ein inhomogenes, sog. evaneszentes elektromagnetisches Nahfeld. In der Totalreflektionsmikroskopie wird dieses Feld zur Fluoreszenzanregung in der Zelle verwendet, und da seine Intensität mit steigendem Abstand von der Oberfläche exponentiell abklingt, beschränkt dies die Fluoreszenzanregung auf eine dünne Schicht unmittelbar auf der Grenzfläche. Aus diesem Grund ist diese Technik in besonderer Weise geeignet, solche zellulären Prozesse zu beobachten, die innerhalb weniger hundert Nanometer Entfernung von der Zellmembran stattfinden.Mit der FRAP-Technik (fluorescence recovery after photobleaching) wird die Geschwindigkeit untersucht, mit der einzelne Clathrin-Moleküle aus dem Gitter aus- und wieder eingebaut werden. Das sich nach einem Bleichpuls wieder erholende Fluoreszenzsignal des Gitters ist eine Exponentialfunktion, deren Zeitkonstante τder Kehrwert der Reaktionsrate koff (Abbindungsrate) ist. Das Reaktionssignal aus dem Gitter wird dabei teilweise durch ein diffusives Signal aus dem Zytosol überdeckt, weshalb die eindeutige Trennung von Reaktions- und Diffusionsignal ein wichtiger Teil dieser Arbeit war, um eine quantitative Abschätzung der Abbindungskinetik zu erlauben.Bei Zimmertemperatur betrug die Zeitkonstante für die Abbindung der Clathrin light chain τLC=18.9±1.3s. Der Austausch der light chain wurde durch Behandlung mit Sucrose, sowie durch Kalzium- und ATP-Depletion blockiert. Für Clathrin heavy chain war die Zeitkonstante der Abbindungsreaktion schneller als für light chain; außerdem waren Kalzium- und ATP-Depletion nicht ausreichend, um den Austausch vollständig zu unterbinden. Daraus schließen wir, daß für heavy chain ein von der light chain unabhängiger Pfad mit schnellerer Zeitkonstante existiert, welcher durch ATP- oder Kalziumdepletion isoliert wird und dessen Zeitkonstante 10.0±0.9s beträgt. Der jeweilige Beitrag der beiden einzelnen Austauschmechanismen wurde experimentell durch die selektive Überexpression einer Clathrin-Untereinheit moduliert.Diese Ergebnisse bestätigen, daß die Anwesenheit der Clathrin light chain die heavy chain Untereinheiten im Gittern stabilisiert, und zeigen, daß in vivo die light chain die Schaltstelle darstellt, über die die Zelle mittels Kalzium und ATP die Clathrinfunktion reguliert.
Schlagwörter: Clathrin; light chain; heavy chain; FRAP; Photobleichen; Austausch; Totalreflektion; Fluoreszenz; Mikroskopie
 

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