Molecular dynamics of clathrin proteins at endocytic sites studied with evanescent-wave microscopy

Abstract

Das Protein Clathrin bildet dreizackförmige Moleküle (Triskelia), die aus je drei light chain- und drei heavy chain-Untereinheiten bestehen. Die Triskelia bauen sich im Zellinneren auf der Oberfläche von Membranen selbständig zu flachen sechseckigen oder zu gewölbten fünfeckigen Gittern zusammen. Clathrin spielt insbesondere für den intrazellulären Transport eine wichtige Rolle; in clathrin pits werden durch steigenden Krümmungsradius des Clathringitters kleine bläschenförmige Einstülpungen der Zellmembran gebildet - Transportvesikel - die anschließend abgeschnürt und ins Zellinnere transportiert werden. Gegenstand dieses Projekts war die Frage, wie die Zelle den selbständigen Aufbau von Clathringittern reguliert. Hierfür wurde mit Totalreflektionsmikroskopie die Kinetik des Austausches von fluoreszenten Konstrukten der beiden Clathrin-Untereinheiten untersucht.Bei der Totalreflektion eines Laserstrahls an einer dielektrischen Grenzfläche, z.B. zwischen Glas und einer Zelle in wässrigem Medium, entsteht im optisch dünneren Medium ein inhomogenes, sog. evaneszentes elektromagnetisches Nahfeld. In der Totalreflektionsmikroskopie wird dieses Feld zur Fluoreszenzanregung in der Zelle verwendet, und da seine Intensität mit steigendem Abstand von der Oberfläche exponentiell abklingt, beschränkt dies die Fluoreszenzanregung auf eine dünne Schicht unmittelbar auf der Grenzfläche. Aus diesem Grund ist diese Technik in besonderer Weise geeignet, solche zellulären Prozesse zu beobachten, die innerhalb weniger hundert Nanometer Entfernung von der Zellmembran stattfinden.Mit der FRAP-Technik (fluorescence recovery after photobleaching) wird die Geschwindigkeit untersucht, mit der einzelne Clathrin-Moleküle aus dem Gitter aus- und wieder eingebaut werden. Das sich nach einem Bleichpuls wieder erholende Fluoreszenzsignal des Gitters ist eine Exponentialfunktion, deren Zeitkonstante τder Kehrwert der Reaktionsrate koff (Abbindungsrate) ist. Das Reaktionssignal aus dem Gitter wird dabei teilweise durch ein diffusives Signal aus dem Zytosol überdeckt, weshalb die eindeutige Trennung von Reaktions- und Diffusionsignal ein wichtiger Teil dieser Arbeit war, um eine quantitative Abschätzung der Abbindungskinetik zu erlauben.Bei Zimmertemperatur betrug die Zeitkonstante für die Abbindung der Clathrin light chain τLC=18.9±1.3s. Der Austausch der light chain wurde durch Behandlung mit Sucrose, sowie durch Kalzium- und ATP-Depletion blockiert. Für Clathrin heavy chain war die Zeitkonstante der Abbindungsreaktion schneller als für light chain; außerdem waren Kalzium- und ATP-Depletion nicht ausreichend, um den Austausch vollständig zu unterbinden. Daraus schließen wir, daß für heavy chain ein von der light chain unabhängiger Pfad mit schnellerer Zeitkonstante existiert, welcher durch ATP- oder Kalziumdepletion isoliert wird und dessen Zeitkonstante 10.0±0.9s beträgt. Der jeweilige Beitrag der beiden einzelnen Austauschmechanismen wurde experimentell durch die selektive Überexpression einer Clathrin-Untereinheit moduliert.Diese Ergebnisse bestätigen, daß die Anwesenheit der Clathrin light chain die heavy chain Untereinheiten im Gittern stabilisiert, und zeigen, daß in vivo die light chain die Schaltstelle darstellt, über die die Zelle mittels Kalzium und ATP die Clathrinfunktion reguliert.