Zur Kurzanzeige

Characterization of the Munc13 - CaM Interaction

dc.contributor.advisorBrose, Nils Prof. Dr.de
dc.contributor.authorDimova, Kalinade
dc.date.accessioned2009-07-06T06:52:55Zde
dc.date.accessioned2013-01-18T14:26:00Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:19Zde
dc.date.issued2009-07-06de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B4FC-3de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-3249
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-3249
dc.description.abstractMunc13-Proteine sind die Hauptakteure beim Priming, einem Vorgang, der an die Plasmamembran angedockte synaptische Vesikel fusionsfähig macht. Im Rahmen dieses essenziellen Schrittes der Ca2+-abhängigen Neurotransmitterfreisetzung spielen Munc13-Proteine weiterhin eine wichtige Rolle bei synaptischen Anpassungsmechanismen wie der präsynaptischen Kurzzeitplastizität. Munc13-1 und ubMunc13-2 enthalten eine konservierte Calmodulin (CaM) Bindungsstelle und die Ca2+-abhängige Wechselwirkung dieser Munc13-Isoformen mit CaM ist als ein molekularer Mechanismus identifiziert worden, der die intrazelluläre Konzentration an Restcalcium (Ca2+i,res) auslesen und als Signal an den präsynaptischen Exocytose-Apparat weitergeben kann. Diese Studie beschreibt die biochemische Charakterisierung der Munc13-CaM Interaktion unter besonderer Berücksichtigung der weiteren Munc13-Isoformen bMunc13-2 und Munc13-3 und liefert Einblicke in die Struktur der Munc13-CaM Komplexe. Mit Hilfe bioinformatischer Analyseverfahren wurde die Anwesenheit potenzieller CaM-Erkennungsmotive auch in den nicht konservierten N-Termini von bMunc13-2 und Munc13-3 vorhergesagt. Von diesen Sequenzmotiven abgeleitete Munc13-Modellpeptide wurden zur Photoaffinitätsmarkierung von CaM eingesetzt und die entstandenen kovalenten Photoaddukte massenspektrometrisch charakterisiert. Die Analyse dieser Peptide-Protein-Interaktionen zeigte, dass alle vier Munc13-Isoformen CaM stöchiometrisch und Ca2+-abhängig binden, und dass diese Bindung bereits durch nur geringfügig erhöhte intrazelluläre Ca2+-Konzentrationen ermöglicht wird. Diese Befunde unterstützen die Schlussfolgerung, dass Konvergenz zu strukturell unterschiedlichen, funktionell jedoch gleichartigen Ca2+/CaM-Bindungsstellen in Munc13-1, ubMunc13-2, bMunc13-2 und Munc13-3 geführt hat, und dass alle Munc13-Isoformen zur präsynaptischen Kurzzeitplastizität beitragen können. Zur strukturellen Charakterisierung der kovalenten Munc13/CaM-Photoaddukte wurde eine innovative analytische Strategie etabliert, die auf Photoaffinitätsmarkierung, isotopenmarkiertem CaM und Massenspektrometrie basiert. So konnte gezeigt werden, dass im gebundenen Zustand die hydrophobe Ankeraminosäure des CaM-Bindungsmotivs von Munc13 zwei Methioninseitenketten in der C-terminalen Domäne von CaM kontaktiert. Diese Kontaktstellen lieferten - zusammen mit durch chemische Quervernetzungsmethoden erhaltene Abstandsbeschränkungen - geeignete Ausgangsbedingungen für ein für molekulares Modelling des Munc13-CaM-Komplexes. Die unter physiologischen Lösungsmittel- und Konzentrationsbedingungen durchführbare Photoaffinitätsmarkierungsanalyse wurde weiterhin eingesetzt, um hochauflösende NMR-Untersuchungen des Munc13/CaM-Komplexes zu komplementieren und die Entdeckung eines neuartigen 1-26 CaM-Bindungsmotiv in Munc13-1 und ubMunc13-2 biochemisch zu unterstützen. Diese strukturellen Informationen über den Munc13/CaM-Komplex eröffnen in Zukunft neue Möglichkeiten für eine detailiertere Erforschung der Rolle von Munc13-Proteinen in den Prozessen des Primings und der präsynaptischen Kurzzeitplastizität.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nd/2.0/de/de
dc.titleCharacterization of the Munc13 - CaM Interactionde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedCharakterisierung der Munc13-CaM-Wechselwirkungde
dc.contributor.refereeBrose, Nils Prof. Dr.de
dc.date.examination2009-05-04de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaftende
dc.subject.dnbBiologiede
dc.description.abstractengThe Munc13 proteins are the key mediators of synaptic vesicle priming, an essential step in Ca2+-regulated neurotransmitter release that renders docked vesicles fusion-competent prior to exocytosis. They have emerged as important regulators of adaptive synaptic mechanisms such as presynaptic short-term plasticity, a process by which the release of neurotransmitter is dynamically adapted to a changing demand. Indeed, Munc13-1 and ubMunc13-2 contain a conserved calmodulin (CaM) binding site and the Ca2+-dependent interaction of these Munc13 isoforms with CaM constitutes a molecular mechanism that transduces residual Ca2+ signaling to the synaptic exocytotic machinery. This study aimed to (i) establish whether such regulation through CaM exists in the other Munc13 isoforms, bMunc13-2 and Munc13-3, and (ii) provide structural insights into the Munc13-CaM interaction. Bioinformatic tools were used to identify potential CaM recognition motifs in the non-conserved sequences of bMunc13-2 and Munc13-3. Munc13-derived model peptides covering the potential CaM binding sites were used in photoaffinity labeling (PAL) experiments with CaM, followed by mass spectrometric characterization of the covalent photoadducts. Analysis of these peptide-protein interactions demonstrated that all four Munc13 isoforms bind CaM in a stoichiometric and Ca2+-dependent manner and that only slightly elevated intracellular Ca2+ concentrations are sufficient to trigger these interactions. These results support the conclusion that convergent evolution has generated structurally distinct but functionally similar Ca2+/CaM binding sites in Munc13-1/ubMunc13-2, bMunc13-2, and Munc13-3, all of which can contribute to presynaptic short-term plasticity. A novel PAL-based analytical strategy using isotopically labeled CaM and mass spectrometry was established for the structural characterization of the covalent Munc13-CaM photoadducts. It revealed that, in the bound state, the hydrophobic anchor residue of the CaM-binding motif in Munc13 contacts two distinct Met residues in the C-terminal domain of CaM. These contact sites provided a valuable basis for molecular modeling of the Munc13-CaM complex through integration with constraints obtained by chemical cross-linking methods. The PAL analysis, carried out under physiological solvent and concentration conditions, also emerged as an important complement to high-resolution NMR studies on the Munc13/CaM interaction, as it yielded biochemical support for a novel 1-26 CaM binding motif in Munc13-1 and ubMunc13-2. The structural data on the Munc13-CaM complex offer new options for future studies towards a deeper understanding of the role of Munc13 proteins in synaptic vesicle priming and short-term synaptic plasticity.de
dc.contributor.coRefereeGriesinger, Christian Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeMelchior, Frauke Prof. Dr.de
dc.subject.topicMolecular Biology & Neurosciences Programde
dc.subject.gerMunc13de
dc.subject.gerCaMde
dc.subject.gerpräsynaptische Kurzzeitplastizitätde
dc.subject.gerPhotoaffinitätsmarkierungde
dc.subject.gerMALDI Massenspektrometriede
dc.subject.engMunc13de
dc.subject.engCaMde
dc.subject.engshort-term synaptic plasticityde
dc.subject.engphotoaffinity labelingde
dc.subject.engMALDI mass spectrometryde
dc.subject.bk42de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2159-1de
dc.identifier.purlwebdoc-2159de
dc.affiliation.instituteGöttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und molekulare Biowissenschaften (GGNB)de
dc.subject.gokfullWAde
dc.identifier.ppn614804183de


Dateien

Thumbnail

Das Dokument erscheint in:

Zur Kurzanzeige