Three-dimensional electron microscopy of structurally heterogeneous biological macromolecules
Dreidimensionale Elektronenmikroskopie von strukturell heterogenen biologischen Makromolekülen
by Florian Hauer
Date of Examination:2009-08-03
Date of issue:2009-10-28
Advisor:Prof. Dr. Holger Stark
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
Referee:Prof. Dr. Reinhard Jahn
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3240
Files in this item
Name:hauer.pdf
Size:6.64Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
The following license files are associated with this item:
Abstract
English
Biological macromolecules exert their biological functions in a dynamic network of large assemblies. The biological function of these macromolecular assemblies is closely related to dynamic movement and rearrangement. Three-dimensional Electron microscopy is the only technique by which dynamic states of large macromolecular complexes can potentially be captured. Currently, methodologies are advancing which allow the reconstitution of structural and functional sub-states from a heterogeneous dataset. Using state-of-the-art biochemical and computational methodology, three-dimensional structures of several biochemically and structurally challenging biological macromolecular complexes have been determined in this work. The structure of the large ribosomal subunit of Thermotoga maritima was reconstructed, displaying several domains which could not be visualized in previous structural studies of ribosomes. The ribosomal L7/L12 stalk, a highly flexible domain which promotes recruitment of translation factors to the ribosome and stimulates their activity, could be visualized in full length. Expansion segments within the ribosomal structure could be identified and localized within the 23S rRNA sequence. As another complex involved in translation, the eukaryotic initiation factor 3 (eIF3) of Saccharomyces cerevisiae was examined. Utilizing GraFix, a universal sample preparation protocol for electron microscopy, intact complexes of eIF3 could be prepared for electron microscopy analysis. During subsequent three-dimensional reconstruction of eIF3 complexes, a protocol for the validation of heterogeneous datasets was proposed. The general applicability of the GraFix protocol was further confirmed by the preparation of highly intact transmembrane complexes of vacuolar V-type ATPases from Thermus thermophilus. Structural heterogeneity of V-ATPases, which has severely impaired previous studies, could be resolved in a set of three-dimensional reconstructions, allowing functional interpretation of domain movements and stochiometry. In order to resolve structural heterogeneity within a data set, a set of reliable initial references is needed. For the ab-initio determination of initial references, the bottleneck of manual correlation of single particle images from different exposure views limits the applicability of the method. To overcome this bottleneck, a software was designed which automatically correlates particles recorded from different views. Thus, initial references can be obtained from large datasets in a semi-automated way, further improving the applicability and reliability of the method.
Keywords: Three-dimensional Cryo Electron Microscopy
Other Languages
Biologische Makromoleküle üben ihre biologische Funktion in einem dynamischen Netzwerk großer Zusammenlagerungen aus. Die biologische Funktion der makromolekularen Komplexe ist dabei eng verbunden mit dynamischen Bewegungen und strukturellen Umlagerungen. Dreidimensionale Kryo-Elektronenmikroskopie ist die einzige Technik, die die dynamischen Zustände von biomakromolekularen Komplexe abbilden kann. Aktuelle methodische Entwicklungen konzentrieren sich insbesondere auf die Rekonstitution von funktionellen und strukturellen Unterzuständen aus einem heterogenen Datensatz. Unter Zuhilfenahme der neuesten biochemischen und computergestützten Methoden wurden im Rahmen dieser Arbeit die dreidimensionalen Strukturen einiger biochemisch und strukturell heterogener biologischer Makromoleküle bestimmt. Die räumliche Struktur der großen ribosomalen Untereinheit von Thermotoga maritima wurde rekonstriert, wobei einige Domänen sichtbar gemacht werden konnte welche in vorhergehenden Studien ribosomaler Komplexe nicht rekonstruiert werden konnten. Der ribosomale L7/L12-Fortsatz, eine hochflexible Domäne welche die Rekrutierung und Aktivierung von Translationsfaktoren unterstützt, konnte in vollem Umfang rekonstruiert werden. Expansionssegmente innerhalb der ribosomalen Struktur konnten identifiziert und innerhalb der 23S rRNA lokalisiert werden. Ein weiterer an der Translation beteiligter Komplex, der eukaryotische Initiationsfaktor 3 (eIF3) aus Saccharomyces cerevisiae wurde untersucht. Unter Verwendung von GraFix, einem universellen Präparationsprotokoll für die elektronenmikroskopische Einzelpartikelanalyse, konnten intakte Komplexe von eIF3 präpariert werden. In der nachfolgenden dreidimensionalen Rekonstruktion des eIF3-Komplexes wurde ein Protokoll zur Validierung von dreidimensionalen Rekonstruktionen aus heterogenen Datensätzen vorgeschlagen. Die generelle Anwendbarkeit des GraFix-Protokolls wurde darüber hinaus durch die Präparation von hochgradig intakten Komplexen der vakuolaren Typ-V ATPasen aus Thermus thermophilus bestätigt. Die strukturelle Heterogenität der V-ATPasen, die sich stark limitierend auf vorherige Studien ausgewirkt hat, konnte in einem Set von dreidimensionalen Strukturen gelöst werden. Hierdurch wurde eine funktionelle Interpretation der Bewegungen und Stöchiometrie der der Untereinheiten möglich. Zur Auflösung von struktureller Heterogenität innerhalb eines Datensatzes ist ein Set von verlässlichen initialen Referenzstrukturen unerlässlich. Für die Bestimmung initialer Referenzstrukturen ab initio besteht der limitierende Schritt aus der manuellen Korrelation von Einzelpartikelbildern aus verschiedenen Aufnahmewinkeln. Um diese Limitation zu überwinden, wurde eine Software entwickelt, die Einzelpartikelbilder aus verschiedenen Aufnahmewinkeln automatisch korreliert. Durch die automatische Korrelation von großen Datensätzen wurde die Anwendbarkeit und Verlässlichkeit der Methode weiter verbessert.
Schlagwörter: Dreidimensionale Kryo-Elektronenmikroskopie