Three-dimensional electron microscopy of structurally heterogeneous biological macromolecules

Abstract

Biologische Makromoleküle üben ihre biologische Funktion in einem dynamischen Netzwerk großer Zusammenlagerungen aus. Die biologische Funktion der makromolekularen Komplexe ist dabei eng verbunden mit dynamischen Bewegungen und strukturellen Umlagerungen. Dreidimensionale Kryo-Elektronenmikroskopie ist die einzige Technik, die die dynamischen Zustände von biomakromolekularen Komplexe abbilden kann. Aktuelle methodische Entwicklungen konzentrieren sich insbesondere auf die Rekonstitution von funktionellen und strukturellen Unterzuständen aus einem heterogenen Datensatz. Unter Zuhilfenahme der neuesten biochemischen und computergestützten Methoden wurden im Rahmen dieser Arbeit die dreidimensionalen Strukturen einiger biochemisch und strukturell heterogener biologischer Makromoleküle bestimmt. Die räumliche Struktur der großen ribosomalen Untereinheit von Thermotoga maritima wurde rekonstriert, wobei einige Domänen sichtbar gemacht werden konnte welche in vorhergehenden Studien ribosomaler Komplexe nicht rekonstruiert werden konnten. Der ribosomale L7/L12-Fortsatz, eine hochflexible Domäne welche die Rekrutierung und Aktivierung von Translationsfaktoren unterstützt, konnte in vollem Umfang rekonstruiert werden. Expansionssegmente innerhalb der ribosomalen Struktur konnten identifiziert und innerhalb der 23S rRNA lokalisiert werden. Ein weiterer an der Translation beteiligter Komplex, der eukaryotische Initiationsfaktor 3 (eIF3) aus Saccharomyces cerevisiae wurde untersucht. Unter Verwendung von GraFix, einem universellen Präparationsprotokoll für die elektronenmikroskopische Einzelpartikelanalyse, konnten intakte Komplexe von eIF3 präpariert werden. In der nachfolgenden dreidimensionalen Rekonstruktion des eIF3-Komplexes wurde ein Protokoll zur Validierung von dreidimensionalen Rekonstruktionen aus heterogenen Datensätzen vorgeschlagen. Die generelle Anwendbarkeit des GraFix-Protokolls wurde darüber hinaus durch die Präparation von hochgradig intakten Komplexen der vakuolaren Typ-V ATPasen aus Thermus thermophilus bestätigt. Die strukturelle Heterogenität der V-ATPasen, die sich stark limitierend auf vorherige Studien ausgewirkt hat, konnte in einem Set von dreidimensionalen Strukturen gelöst werden. Hierdurch wurde eine funktionelle Interpretation der Bewegungen und Stöchiometrie der der Untereinheiten möglich. Zur Auflösung von struktureller Heterogenität innerhalb eines Datensatzes ist ein Set von verlässlichen initialen Referenzstrukturen unerlässlich. Für die Bestimmung initialer Referenzstrukturen ab initio besteht der limitierende Schritt aus der manuellen Korrelation von Einzelpartikelbildern aus verschiedenen Aufnahmewinkeln. Um diese Limitation zu überwinden, wurde eine Software entwickelt, die Einzelpartikelbilder aus verschiedenen Aufnahmewinkeln automatisch korreliert. Durch die automatische Korrelation von großen Datensätzen wurde die Anwendbarkeit und Verlässlichkeit der Methode weiter verbessert.