Investigation of SNARE function in the early endosomal compartment
Untersuchung der Funktion von SNARE Proteinen im frühendosomalen Kompartiment
by Ioanna Bethani
Date of Examination:2009-04-29
Date of issue:2009-12-07
Advisor:Prof. Dr. Reinhard Jahn
Referee:Prof. Dr. Nils Brose
Referee:Prof. Dr. Evgeni Ponimaskin
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor (SNARE) proteins catalyze organelle fusion in the secretory pathway. Di erent fusion steps are mediated by speci.c SNARE sets. By studying homotypic early endosomal fusion in neuroendocrine PC12 cells, I investigated how the speci.city of SNARE function is regulated. Even though early endosomal and exocytic SNAREs promote distinct fusion events (early endosomal fusion and exocytosis, respectively), they colocalize on the early endosomal membrane and associate in promiscuous cis-complexes, in a mass-action-dependent manner. I showed that two combinatorial mechanisms account for the speci.city in SNARE pairing and function: the enrichment of the necessary SNAREs at the prospective fusion sites, and preference for cognate SNARE associations in trans. To test the robustness of this highly regulated system under stress conditions, such as poor availability of its components, I downregulated by siRNA means the amount of single early endosomal or exocytic SNAREs in PC12 cells. Surprisingly, knock-down of early endosomal SNAREs, alone or in combinations, did not result in measurable changes of endosomal trafficking or fusion. I found that the residual SNARE levels (typically about 10%) were sufficient for a substantial amount of SNARE-SNARE interactions and that in wild type cells most SNARE molecules were concentrated in clusters, constituting a spare pool not readily available for interactions. Additionally, the organelles derived from the knock-down cell lines recruited more of the tethering factor EAA1 and exhibited enhanced docking. I therefore conclude that, surprisingly, SNAREs are expressed at much higher levels than needed for maintenance of organelle fusion, and that loss of SNAREs is compensated for by the co-regulation of the docking machinery, providing an additional example on the importance of cooperative functions for the regulation of intracellular fusion.
Keywords: SNARE; membrane fusion; early endosomes; siRNA
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Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor (SNARE) Proteine katalysieren die Fusion von Organellen in der sekretorischen Bahn. Verschiedene Fusionsereignisse werden von spezifischen Gruppen von SNAREs vermittelt. Um zu verstehen wie die Spezifität der SNARE Funktion reguliert ist, untersuchte ich die homotypische Fusion von frühen endosomalen Organellen ( early endosomes ) in neuroendocrinen PC12 Zellen. Obwohl frühe endosomale und exozytische SNAREs verschiedene Fusionsabläufe fördern (frühe ensdosomale Fusion bzw. Exozytose), kolokalisieren sie in früh- endosomalen Membranen und assoziieren miteinander in cis-Komplexen in abhängig von ihrer Dichte. Ich konnte zeigen, dass zwei Mechanismen für die Spezifität der Paarung und Funktion von SNARE Molekülen verantwortlich sind: Die Anreicherung der erforderlichen SNAREs in der potenziellen Fusionsstelle sowie die Bevorzugung artverwandter SNAREs bei Bindung in trans. Um die Robustheit dieses streng regulierten Systems unter Stressbedingungen, wie z.B. geringer Verfügbarkeit der Komponenten, zu testen, verringerte ich die Anzahl früher endosomaler bzw. exozytischer SNAREs in PC12 Zellen unter Nutzung von siRNA. Überraschenderweise ergab das herab-regulieren früher endosomaler SNAREs - einzeln oder in Kombination - keine messbare Veränderung in Bezug auf endosomalen Verkehr oder endosomale Fusion. Ich fand heraus, dass die verbleibenden Mengen an SNARE Proteinen (üblicherweise 10%) für substantielle SNARE-SNARE Interaktionen ausreichen. Darüber hinaus sind in Wildtyp-Zellen die meisten SNARE Moleküle in Clustern konzentriert und bilden dadurch ein Reservoir von Molekülen welche nicht unmittelbar für Fusionsvorgänge zur Verfügung stehen. Weiterhin rekrutierten Organellen aus herunter-regulierten Zellenlinien größere Mengen des Dockingfaktors EAA1 und zeigten häufigere Anlagerung an die Zellmembran. Aufgrund dieser Ergebnisse komme ich zu dem überraschenden Schluss, dass SNARE Moleküle deutlich stärker exprimiert werden als für die Unterhaltung der Fusion von Organellen nötig wäre, und dass eine Reduzierung von SNARE Molekülen durch eine entsprechende Co-Regulierung der Dockingmaschinerie kompensiert wird. Diese Ergebnisse sind ein weiteres Beispiel für die Bedeutung kooperativer Funktionen für die Regulierung intrazellulärer Fusion.
Schlagwörter: SNARE Proteinen; Fusion; frühe Endosomen; siRNA