Investigation of SNARE function in the early endosomal compartment

Abstract

Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor (SNARE) Proteine katalysieren die Fusion von Organellen in der sekretorischen Bahn. Verschiedene Fusionsereignisse werden von spezifischen Gruppen von SNAREs vermittelt. Um zu verstehen wie die Spezifität der SNARE Funktion reguliert ist, untersuchte ich die homotypische Fusion von frühen endosomalen Organellen ( early endosomes ) in neuroendocrinen PC12 Zellen. Obwohl frühe endosomale und exozytische SNAREs verschiedene Fusionsabläufe fördern (frühe ensdosomale Fusion bzw. Exozytose), kolokalisieren sie in früh- endosomalen Membranen und assoziieren miteinander in cis-Komplexen in abhängig von ihrer Dichte. Ich konnte zeigen, dass zwei Mechanismen für die Spezifität der Paarung und Funktion von SNARE Molekülen verantwortlich sind: Die Anreicherung der erforderlichen SNAREs in der potenziellen Fusionsstelle sowie die Bevorzugung artverwandter SNAREs bei Bindung in trans. Um die Robustheit dieses streng regulierten Systems unter Stressbedingungen, wie z.B. geringer Verfügbarkeit der Komponenten, zu testen, verringerte ich die Anzahl früher endosomaler bzw. exozytischer SNAREs in PC12 Zellen unter Nutzung von siRNA. Überraschenderweise ergab das herab-regulieren früher endosomaler SNAREs - einzeln oder in Kombination - keine messbare Veränderung in Bezug auf endosomalen Verkehr oder endosomale Fusion. Ich fand heraus, dass die verbleibenden Mengen an SNARE Proteinen (üblicherweise 10%) für substantielle SNARE-SNARE Interaktionen ausreichen. Darüber hinaus sind in Wildtyp-Zellen die meisten SNARE Moleküle in Clustern konzentriert und bilden dadurch ein Reservoir von Molekülen welche nicht unmittelbar für Fusionsvorgänge zur Verfügung stehen. Weiterhin rekrutierten Organellen aus herunter-regulierten Zellenlinien größere Mengen des Dockingfaktors EAA1 und zeigten häufigere Anlagerung an die Zellmembran. Aufgrund dieser Ergebnisse komme ich zu dem überraschenden Schluss, dass SNARE Moleküle deutlich stärker exprimiert werden als für die Unterhaltung der Fusion von Organellen nötig wäre, und dass eine Reduzierung von SNARE Molekülen durch eine entsprechende Co-Regulierung der Dockingmaschinerie kompensiert wird. Diese Ergebnisse sind ein weiteres Beispiel für die Bedeutung kooperativer Funktionen für die Regulierung intrazellulärer Fusion.