The function of PTK7 during Xenopus neural crest migration
Die Funktion von PTK7 in der Neuralleistenzellmigration in Xenopus laevis
by Iryna Shnitsar
Date of Examination:2009-12-14
Date of issue:2009-12-18
Advisor:Dr. Annette Borchers
Referee:Prof. Dr. Michael Kessel
Referee:Prof. Dr. Andreas Wodarz
Referee:Prof. Dr. Ernst A. Wimmer
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
PTK7 is a novel component of the planar cell polarity (PCP) signaling pathway, which regulates inner ear hair cell polarity and neural tube closure, however, its signaling mechanism is largely unknown. In Xenopus PTK7 is expressed in the closing neural tube as well as the migrating neural crest indicating a function in the regulation of these morphogenetic movements. For neural tube closure this has already been demonstrated, but the role of PTK7 in neural crest migration is unclear. The aim of this PhD project was to analyze if PTK7 affects neural crest migration and to characterize how it intersects with the PCP signaling pathway to regulate cell movements. Analyzing protein co-localization in Xenopus ectodermal explants, demonstrated that PTK7 recruits dsh to the plasma membrane. Further, co-immunoprecipitation experiments revealed that PTK7 is a component of the fz7-dsh complex, which is necessary for the fz7-dependent dsh membrane recruitment and phosphorylation. As our data indicated that the PTK7-dsh interaction is not direct, tandem mass-spectrometry analysis was employed to identify novel PTK7 binding partners. In the result, the receptor of activated PKC 1 (RACK1) was identified. RACK1 has a similar expression pattern like PTK7 and binds to PTK7 in immunoprecipitation experiments. Similar to PTK7, RACK1 loss of function disturbs neural tube closure. Furthermore, loss of function studies demonstrate that RACK1 is required for PTK7-mediated dsh localization. The analysis of protein-protein interactions and co-localization demonstrates that RACK1 interacts with PKCδ1 and the complex with PKCδ1 and RACK1 mediates PTK7-dependent dsh membrane recruitment. Loss of function studies demonstrate that PTK7 is required for neural crest migration. Expressing of the full-length PTK7 and its deletion constructs under the control of the neural crest-specific slug promoter shows that PTK7 is specifically required in migrating neural crest cells. Epistasis experiments indicate that PTK7 interacts with dsh to regulate neural crest migration.
Keywords: Xenopus; neural crest; PCP signaling; PTK7
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PTK7 ist ein neuer Bestandteil des Signalwegs der planaren Zellpolarität (PCP), welcher die Polarität der Innenohrhaarzellen und den Neuralrohrschluss reguliert. Der Signalmechanismus jedoch ist weitgehend unbekannt. In Xenopus wird PTK7 im Neuralrohr sowie in den Neuralleistenzellen exprimiert, was eine Funktion in der Regulation morphogenetischer Bewegungen anzeigt. Für den Neuralrohrschluss ist dieses bereits demonstriert worden, doch die Rolle von PTK7 bei der Migration der Neuralleistenzellen ist unklar. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, zu analysieren, ob PTK7 die Neuralleistenzellmigration beeinflusst und wie dieses mit dem PCP-Signalweg in Verbindung steht, um Zellbewegungen zu regulieren. Die Untersuchung von Protein Ko-lokalisationen in ektodermalen Explantaten von Xenopus Embryonen hat gezeigt, dass dsh durch PTK7 zur Plasmamembran transloziert wird. Durch Ko-Immuno- präzipitationsexperimente konnte weiterhin gezeigt werden, dass PTK7 ein Bestandteil des fz7-dsh Komplexes ist, der für die fz7-abhängige dsh Membranrekrutierung und Phosphorylierung notwendig ist. Da unsere Daten zeigten, dass die PTK7-dsh Interaktion nicht direkt ist, wurde eine Tandem-Massenspektrometrie Analyse durchgeführt, um neue Bindungspartner von PTK7 zu identifizieren. Als Bindungspartner von PTK7 wurde receptor of activated PKC 1 (RACK1) identifiziert. RACK1 hat ein ähnliches Expressionsmuster wie PTK7 und in Immuno-präzipitationsexperimenten wurde eine Bindung von RACK1 und PTK7 gezeigt. Der Funktionsverlust von RACK1 führt ebenso wie der von PTK7 zu Defekten beim Neuralrohrschluss. In den gleichen Experimenten wurde außerdem gezeigt, dass RACK1 für die durch PTK7 vermittelte dsh Lokalisierung benötigt wird. Die Analyse der Protein-Protein-Interaktionen sowie Ko-Lokalisationsstudien zeigten, dass RACK1 mit PKCδ1 interagiert und der PKCδ1-RACK1 Komplex die PTK7-abhängige dsh Membranrekrutierung vermittelt. Der Funktionsverlust von PTK7 demonstriert, dass dieses Protein für die Neuralleistenzellmigration erforderli ch ist. Durch die Expression des kompletten PTK7 Proteins sowie von Deletionsmutanten unter der Kontrolle des neuralleistenzellspezifischen Slug-Promotors, konnte gezeigt werden, dass PTK7 speziell in migrierenden Neuralleistenzellen benötigt wird. Eine genetische Interaktion von PTK7 mit dsh zur Regulation von Neuralleistenzellmigration wurde gezeigt.
Schlagwörter: Xenopus; Neuralleist; PCP Signalweg; PTK7