On the putative role of Pelota in stem cell differentiation
On the putative role of Pelota in stem cell differentiation
by Aleksandra Kata
Date of Examination:2010-01-19
Date of issue:2010-04-20
Advisor:Prof. Dr. Dr. Wolfgang Engel
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Engel
Referee:Prof. Dr. Sigrid Hoyer-Fender
Files in this item
Name:kata.pdf
Size:12.8Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
In this work we analyzed the role of pelota in the conditional knockout mouse model. We shed light on its function during development and report the defects resulting from Pelota depletion. We demonstrated that recombination of floxed Pelo allele was complete in ESC system and sufficiently efficient to study PELO depletion in mouse. We successfully generated a Pelo./-CreERT ES cell line. It did not exhibit any proliferation disorder, but the cells were defective in differentiation capacities. They sustained Oct4 expression, and miR-290 cluster specific for pluripotent cells seemed to be upregulated under differentiation conditions. The ectoderm formation was not affected, but analysis of early and late markers, specific for mesoderm and endoderm revealed that both lineages are not formed in the mutant cells. To confirm the hypothesis, we studied differentiation capacities of adult stem cells, i.e. hematopoietic stem cells and spermatogonial stem cells. Analysis of spermatogenesis revealed that all developmental stages of germ cells are absent. For more comprehensive studies, we generated testis-specific Pelo./-Stra8-Cre mice, which let us follow the effect of PELO deletion on spermatogenesis progression. The analysis of the testes showed arrest in spermatogenic progression during the onset of meiotic division (day 15). In 10-day-old testes we detected a decrease in expression of Stra8, Dazl and Ddx4, which are markers for premeiotic stages of germ cells. However, we could not find any PELO deletion effect on the level of either undifferentiated (Plzf and Sox3 markers) or differentiated (c-Kit marker) spermatogonia. This suggests that pelota exerts the effect on entry into meiosis, that is the beginning of germ cell differentiation. Unexpectedly, we also found mosaic mice with partially deleted Pelo allele (PeloF/./-Stra8-Cre) in different somatic tissues, including kidney, liver, heart, spleen, lungs, what indicates Stra8 expression in early embryogenesis. The studies of mature B and T cells isolated from spleen and thymus of mutant mice revealed the reduction in cell number. Additionally, we detected strong increase of double negative cells (CD4-CD8-), which are developmental precursors of T cells. Simultanously, we observed a dramatic decrease in the level of all later developmental stages of T cells. All these data confirm the failure in differentiation abilities of mutant cells. Adham et al. (2003) studied pelota function in the Pelo knockout mouse. The phenotype of homozygous mutants (Pelo-/-) was lethal during early stages of embryogenesis. To confirm that this phenotype results from pelota inactivation, we crossed Pelo+/- mice with transgenic PeloT mice, which rescued the lethal phenotype. This clearly demonstrates the direct relation between lethality and Pelo depletion. The transgenic mice overexpressiong PELO in testis-specific manner did not show any phenotype. The mice were fertile and histological analysis demonstrated that spermatogenesis is not disrupted.
Keywords: Pelota; stem cell; mesoderm; pluripotency
Other Languages
In dieser Arbeit analysierten wir die Rolle von Pelota in dem conditionalen Knock out Mausmodel . Wir haben licht auf seine Funktion während der Entwicklung geworfen und berichten über defekte die aus dem Pelota Abbau resultieren.Wir haben erfolgreich eine Pelo?/- CreERT ES-Zelllinie erzeugt. Diese Zelllinie hatte keine Anlage zu einer Proliferation Funktionsstörung, aber die Zellen hatten einen Defekt in ihren differenzierungs- Kapazitäten. Sie zeigten eine durchgehende Oct4 Expression und miR-290, clusterspezifisch für Pluripontente Zellen, schien unter differenzierungs Bedingungen herraufreguliert. Die Ectoderm Formation war nicht betroffen, aber eine Analyse von frühen und späten Markern, spezifisch für Mesoderm und Entoderm enthüllte das in den mutanten Zellen Beide Keimschichten nicht ausgebildet werden. Um diese Hypothese zu bestätigen, untersuchten wir die Differenzierungs-Kapazität von adulten Stammzellen, z.B hämatopoetischen Stammzellen.Die Untersuchung der Spermatogenese ergab das alle Entwicklungs Stadien der Keimzellen fehlen. Für umfangreichere Studien erzeugten wir eine Testis spezifische Pelo?/- Stra8-Cre Maus, welche uns den Effekt der Pelo Deletion bei der Spematogenese aufzeigen sollte. Die Analyse der Testes zeigte einen Arrest in der Spermatogenese Entwicklung während des Beginns der meiotischen Teilung (Tag 15). In 10 Tage alten Testes fanden wir eine Abnahme in der Expression von Stra8, Dazl and Ddx4, dieses sind Marker für prämeiotische Stadien von Keimzellen. Trotzdem konnten wir weder auf der Ebene der undifferenzierten ( Plzf und Sox3 ) noch der differenzierten ( c-Kit ) Spermatogonien, einen Pelo deletions Effekt feststellen. Dies legt nahe das Pelota Auswirkungen auf den Beginn der Meiose hat, welche der Beginn der Keimzell Differenzierung ist. Unerwartet fanden wir auch Mosaik Mäuse mit teilweise deletierten Allel (PeloF/?/-Stra-Cre), in verschiedenen somatischen Geweben, inklusive Niere, Leber, Herz, Milz, Lunge, dies Ergebnis deutet Stra8 Expression in der frühen Embryogenese an.Die Studien der gereiften B und T Zellen, die aus Milz und Thymus der Mutanten Mäuse isoliert wurden, offenbarten eine Reduktion der Zell Nummer. Zusätzlich entdeckten wir einen starken Anstieg von doppelt negativen Zellen (CD4- CD8-),diese sind Entwicklungs- Vorstufen von T Zellen. Gleichzeitig bemerkten wir eine dramatische Abnahme auf allen Ebenen der späten Entwicklungsphase der T Zellen. Alle diese Daten bestätigen das Versagen der Differenzierungs-Fähigkeit der Mutanten Zellen.Adham et al. Untersuchte die Pelota Funktion in der Pelota Knock Out Maus. Der Phänotyp der homozygoten Mutanten (Pelo-/-) war letal während der frühen Phase der Embryonal Entwicklung. Um zu bestätigen das dieser Phänotyp aus der Pelota Inaktivierung resultiert, kreuzten wir Pelota+/- Mäuse mit Transgenen Pelo T Mäusen, welches den letalen Phänotyp rettete. Dies demonstriert deutlich den direkten Zusammenhang zwischen der Sterblichkeit und den Pelota Abbau.Die Transgenen Mäuse die Pelo in Testes spezifischer art und weise überexprimierten, zeigten keinen Phänotyp. Die Mäuse waren fertil und die histologischen Analysen kamen zu dem Ergebnis, das die Spermatogenese nicht gestört ist.
Schlagwörter: Pelota; Stamzellen; Mesoderm; Pluripotenz