Subcellular localization of Kv10.1 (Eag1): functional ion channels on the inner nuclear membrane
Subzelluläre Lokalisation von Kv10.1 (Eag1): funktionelle Ionenkanäle auf der inneren Kernmembran
by Ye Chen
Date of Examination:2010-04-29
Date of issue:2010-07-01
Advisor:Dr. Luis A. Pardo
Referee:Prof. Dr. Walter Stühmer
Referee:Prof. Dr. Dirk Fasshauer
Referee:Prof. Dr. Jakob Sørensen
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3320
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Description:Dissertation
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Abstract
English
hEag1 (human ether-a-go-go-1, Kv10.1) is a voltage-gated potassium channel expressed mostly in the brain in healthy subjects but also in many tumors under pathological conditions. Its ability to induce malignant transformation and to favour tumor progression can t be attributed entirely to its potassium permeation. hEag1 was shown to co-localize with lamin A/C. And electron microscopy studies in neurons and tumor cells indicated that it is localized at the inner nuclear membrane. The aim of the thesis was to confirm this localization. The peri-nuclear hEag1 fulfils the established criteria for transmembrane proteins targeted to the inner nuclear membrane. The peri-nuclear hEag1 was not accessible to antibodies unless the nuclear envelope was permeabilized. Compared to the cytoplasm population, the peri-nuclear population was more resistant to Triton X-100 extraction and less mobile in lateral diffusion in FRAP analysis. It was also frequently found in the NPC-free island , which normally associates with the heterochromatin. All these characters suggest a tight interaction with nuclear lamina, other inner nuclear membrane proteins or chromatin. Furthermore, in density gradient centrifugation of extracts from both heterologous and native systems, hEag1 was enriched in fractions containing known inner nuclear membrane proteins. It was also shown that hEag1 at the inner nuclear membrane is functional as an ion channel. Single channel currents detected at the inner nuclear membrane were compatible with that of hEag1 in terms of conductance and pharmacologic properties (inhibition by astemizole and a specific monoclonal antibody). This current was not detected in non-transfected cells. Moreover, the opening probability was higher when the pipette voltage was more negative, suggesting that hEag1 in the inner nuclear membrane has its N and C termini facing the nucleoplasm. Our experiments strongly suggest that the channel is integrated in the inner nuclear membrane, with its N and C-termini exposed to the nucleoplasm, possibly in contact with the heterochromatin.
Keywords: Eag1; Kv10.1; potassium channel; tumor; brain; subcellular localization; inner nuclear membrane
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hEag1 (humaner ether-a-go-go-1, Kv10.1) ist ein spannnungsabhängiger Kaliumkanal, dessen Expression sich bei gesunden Menschen hauptsächlich auf das Gehirn beschränkt, unter pathologischen Bedingungen jedoch auch in Tumoren zu finden ist. Seine Fähigkeit, eine maligne Transformation auszulösen und die Tumorprogression zu begünstigen, kann nicht allein der Kalium-permeation zugeschrieben werden. Es wurde gezeigt, dass hEag1 mit lamin A/C co-lokalisiert. Weiterhin deuten elektronenmikroskopische Untersuchungen an Neuronen und Tumorzellen darauf hin, dass es in der inneren Kernmembran vorkommt. Das Ziel dieser Studie war es, diese Lokalisierung zu bestätigen. Das kernperiphäre hEag1 erfüllt die vorhandenen Kriterien für transmembrane Proteine, die in der inneren Kernmembran vorhanden sind. Für Antikörper war das kernperiphäre hEag1 nicht zugänglich, es sei denn, die Kernhülle wurde permeabilisiert. Verglichen mit dem zytoplasmatischen Vorkommen war das kernperiphäre resistenter für die Triton X-100 Extraktion und weniger mobil in der lateralen Diffusion in FRAP Analysen. Außerdem wird es häufiger in den NPC-free island gefunden, welche nomalerweise mit Heterochromatin assoziieren. All diese Befunde deuten auf eine enge Interaktion mit der Kernlamina, anderen kernmembranständigen Proteinen oder Chromatin hin. In der Dichtegradientenzentrifugation von Extrakten aus heterologen als auch nativen Systemen wurde hEag1 verstärkt in Fraktionen gefunden, die auch bekannte Proteine aus der inneren Kernmembran beinhalteten. Weiterhin wurde gezeigt, dass hEag1 in der inneren Kernmembran als Ionenkanal fungiert. Einzelkanalströme, welche in der inneren Kernmembran gefunden wurden, stimmten in der Leitfähigkeit und den pharmakologischen Eigenschaften (inhibiert durch Astemizol und einem spezifischen monoklonalen Antikörper) mit der von hEag1 überein. In nicht transfizierten Zellen wurde diese Spannung nicht gefunden. Weiterhin war die Wahrscheinlichkeit eines offenen Kanals höher, wenn das elektrische Potential der Pipette negativer war, was darauf hindeutet, dass die N- und C-terminalen Enden von hEag1 in der inneren Kernmembran zum Nukleoplasma hin gerichtet sind. Unsere Experimente deuten stark darauf hin, dass der Kanal in die innere Kernmembran integriert ist, wobei seine N- und C-terminalen Enden zum Nukleoplasma ausgerichtet sind und möglicherweise mit dem Heterochromatin in Kontakt ist.
Schlagwörter: Eag1; Kv10.1; Kaliumkanal; Tumoren; Gehirm; Subzelluläre Lokalisation; inneren Kernmembran
