Molecular Sizing using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Abstract

Die Größe ist eine grundlegende Eigenschaft eines jeden Objektes, speziell von Molekülen. Sie ist direkt verbunden mit fundamentalen Phänomenen, wie z.B. der Diffusion, und zwar unabhängig von anderen Eigenschaften. Die Größe von Molekülen kann sich ändern, wenn sie mit anderen Molekülen wechselwirken (z. B. wenn sie Ionen binden), oder wenn die Temperatur, der pH-Wert oder die chemische Zusammensetzung des umgebenden Mediums sich ändert. Somit kann die Größe ein sehr sensitiver Reporter für den Zustand eines Moleküls sein. Daher findet die Größenbestimmung von Molekülen breite Anwendung in der Physik, der Chemie und der Biologie. In den meisten Fällen erfordern diese Anwendungen eine Größenbestimmung mit einer Genauigkeit von wenigen Angström. In dieser Arbeit untersuche ich die Größe von Molekülen bei pico- und nanomolaren Konzentrationen mittels hoch-genauer Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS). Eine spezielle Abwandlung dieser Methode, die zwei-Focus FCS (2fFCS) erlaubt die Bestimmung des absoluten Diffusionskoeffizienten und somit auch der absoluten Größe eines Moleküls. Die Genauigkeit dieser Methodik wird unter anderen anhand weit verbreiteter globulärer Proteine bestimmt. Weiterhin wird die gemessene quantitative Beziehung zwischen dem molekularen Gewicht und dem gemessenen Diffusionskoeffizienten diskutiert. Ausgehend von der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie habe ich eine neue Methode entwickelt, die Rotations-Diffusions-Konstanten von Makromolekülen bestimmt. Diese Methode ist geeignet, um Rotations-Diffusions-Konstanten zwischen zehn und einhundert Nanosekunden zu bestimmen, also einem Bereich in dem Fluoreszenz-Anisotropie-Messungen nicht gut angewendet werden können. Mittels des gemessenen Rotations-Diffusions-Koeffizienten wurden die hydrodynamischen Radien einiger weitverbreiteter, globulärer Proteine bestimmt. Die erhaltenen Werte werden mit den Resultaten aus den Diffusionsmessungen verglichen.