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Investigation of Endosomal Recycling of Synaptic Vesicles

dc.contributor.advisorRizzoli, Silvio Prof. Dr.de
dc.contributor.authorHoopmann, Peerde
dc.date.accessioned2010-11-05T06:54:23Zde
dc.date.accessioned2013-01-18T14:21:39Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:17Zde
dc.date.issued2010-11-05de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B521-0de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-3146
dc.description.abstractWährend der Kommunikation in chemischen Synapsen verschmelzen kleine mit Neurotransmitter gefüllte synaptische Vesikel, die sich in der prä-synaptischen Nervenendigung (Bouton) befinden, mit der Zellmembran (Exozytose) and entlassen ihren Neurotransmitter in den synaptischen Spalt. Die Vesikel werden zurück in das Bouton gestülpt (Endozytose), wo sie mit neu befüllt werden und für weitere Exozytose-Runden in den Vesikel Pool integriert werden (Vesikel Recycling). Wie synaptische Vesikel wiederverwertet werden wird bereits seit mehr als drei Jahrzehnten diskutiert. Hier haben wir die Beteiligung von Endosomen beim Recycling von synaptischen Vesikeln anhand einer Vielzahl an Bildgebungsverfahren untersucht. Erstens haben wir drei neue Exozytose-Reporter generiert, indem wir eine pH-abhängige GFP Variante (pHluorin) mit der lumenalen Domäne der endosomalen Proteine Vti1a, Syntaxin 13 und Syntaxin 6 gekoppelt haben. Wir haben diese Reporter in Hippocampus Neuronen exprimiert und ihre Zirkulation während verschiedener Stimulationen verglichen. Dabei haben wir gefunden, dass sie vorzugsweise durch eine readily releasable pool Stimulation (RRP; 20Hz / 2 Sekunden) mobilisiert werden. Zweitens, indem wir Photo-oxidations Elektronen Mikroskopie von FM Farbstoff-gefärbten RRP Vesikeln verwendet haben, haben wir das vorübergehende Aufkommen großer gefärbter Organellen 10 Sekunden nach der Stimulation beobachtet, was auf die Verschmelzung von endozytierten Vesikeln mit Endosomen hindeutete. Als nächstes haben wir hochauflösende Dünnschnitt STED Mikroskopie und Video-geschwindigkeits Live-STED Mikroskopie angewendet um zu bestätigen, dass RRP Vesikel mit Endosomen (gekennzeichnet durch Rab5-GFP) verschmelzen. Interessanterweise schien stärkere recycling pool Stimulation (20 Hz / 30 Sekunden) keine bessere Kolokalisation von Vesikeln und Endosomen hervorzurufen. Drittens haben wir zytosolische Syntaxin 13 Fragmente exprimiert um die Bildung von endosomalen Fusionskomplexen, und somit die Verschmelzung von Vesikeln und Endosomen, zu blockieren. Auffallenderweise zog diese Störung eine drastische ~60% Reduktion der RRP Größe nach sich, was die Wichtigkeit endosomaler Funktion für den RRP hervorhebt. Viertens zeigten 2-Farben STED Messungen, dass synaptische Vesikel in der Zellmembran als mehr-Komponenten Verbünde bestehen, während der Vergleich von allgemeinem Pool und kürzlich endozytiertem Pool isolierter Vesikel aufdeckte, dass Endozytose unreine Vesikel zurückgewinnt und so endosomales Aufreinigen bedingt. Dies ist eine der ersten Untersuchungen, die einen molekularen und mechanistischen Bestimmungsfaktor von RRP Vesikeln vorschlägt. Wir schlussfolgern, dass die RRP Vesikel in einem hochgradig Verschmelzungs-kompetenten Zustand erhalten werden da sie durch Endosomen geschleust werden, so dass sie die privilegierten Vesikel sind, die während physiologischer Aktivität benutzt werden.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de
dc.titleInvestigation of Endosomal Recycling of Synaptic Vesiclesde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedUntersuchung von endosomalem Recycling von synaptischen Vesikelnde
dc.contributor.refereeRizzoli, Silvio Prof. Dr.de
dc.date.examination2010-11-02de
dc.subject.dnb500 Naturwissenschaftende
dc.description.abstractengDuring communication at chemical synapses, small neurotransmitter-filled synaptic vesicles, housed in the pre-synaptic nerve terminal (bouton), fuse with the plasma membrane (exocytosis) and release their neurotransmitter content into the synaptic cleft. The fused synaptic vesicles are retrieved into the bouton (endocytosis), where they are refilled with neurotransmitter and re-integrated into the synaptic vesicle pool for further rounds of exocytosis (vesicle recycling). Through which pathways the synaptic vesicles recycle has been a matter of debate for more than three decades. Here we investigated the involvement of endosomes in the recycling of synaptic vesicles by resorting to a variety of novel imaging approaches. First, we generated three novel exocytosis reporters by fusing a pH-sensitive GFP variant (pHluorin) to the lumenal domain of the early endosomal fusion proteins Vti1a, Syntaxin 13 and Syntaxin 6. We compared the recycling of these reporters expressed in hippocampal neurons upon different stimulation paradigms and found them to be preferentially mobilized during readily releasable pool stimulation (RRP; 20 Hz/ 2 seconds). Second, using photo-oxidation electron microscopy of FM dye-labeled RRP vesicles, we observed a transient appearance of larger labeled organelles at 10 seconds after stimulation, indicative of endosomal fusion of endocytosed vesicles. We next used high-resolution thin-section STED microscopy and video-rate live-STED microscopy, to confirm that endocytosed RRP vesicles fuse with bona fide endosomes (identified by Rab5-GFP). Interestingly, stronger recycling pool stimulation (20 Hz/30 seconds) did not seem to result in higher colocalization of vesicles and endosomes in these experiments. Third, we used expression of soluble Syntaxin 13 fragment to block formation of endosomal fusion complexes and therefore endosomal fusion of synaptic vesicles. Strikingly, this perturbation resulted in a drastic ~60% decrease in RRP size, underscoring the importance of endosomal function for the RRP. Fourth, 2-color STED measurements indicated that synaptic vesicles persist as multi-component clusters in the plasma membrane, while comparison of the composition of general pool and recently endocytosed isolated synaptic vesicles revealed that endocytosis causes retrieval of dirty vesicles, thus necessitating endosomal sorting. This is one of the first studies proposing a molecular and mechanistic determinant of RRP vesicles. We conclude that the RRP vesicles are maintained in a highly fusion-competent state by recycling through endosomes, making them the privileged vesicles drawn upon during physiological activity.de
dc.contributor.coRefereeJahn, Reinhard Prof. Dr.de
dc.subject.topicMolecular Biology & Neurosciences Programde
dc.subject.gerreadily releasable poolde
dc.subject.gerstimulated emission depletion Mikroskopiede
dc.subject.gerEndosomde
dc.subject.gersynaptisches Vesikelde
dc.subject.gerRecyclingde
dc.subject.engreadily releasable poolde
dc.subject.engstimulated emission depletion microscopyde
dc.subject.engendosomede
dc.subject.engsynaptic vesiclede
dc.subject.engrecyclingde
dc.subject.bk42.15de
dc.subject.bk42.63de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2686-5de
dc.identifier.purlwebdoc-2686de
dc.affiliation.instituteGöttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und molekulare Biowissenschaften (GGNB)de
dc.subject.gokfullWHC 500: Organellende
dc.subject.gokfullZellorganellen {Cytologie}de
dc.identifier.ppn641481764de


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