| dc.description.abstract | Trypanosomen sind einzellige Blutstromparasiten und Erreger der in Afrika weit verbreiteten Schlafkrankheit des Menschen, sowie der Nagana Seuche in landwirtschaftlichen Nutztieren. Die Krankheit wird durch den Biss der Tsetsefliege übertragen und endet ohne medizinische Behandlung mit dem Tod des jeweiligen Wirtes. Der Name ist der griechischen Sprache entlehnt (Trypanosoma = Bohrkörperchen) und beschreibt bildlich den unter dem Mikroskop sichtbaren Bewegungsablauf, welcher auf dem ersten Blick dem Verlauf einer Korkenzieher Spindel ähnelt. Bei genauerer Betrachtung wird jedoch deutlich, dass die tatsächliche Bewegung der Zellen nicht nur wesentlich komplexer als bisher beschrieben ist, sondern auch von Zelle zu Zelle sowie über die Zeit variiert. Des Weiteren gilt die Frage zu klären, warum sich Zellen, die im Blutstrom leben, überhaupt aktiv bewegen, sind Sie doch nicht annähernd schnell genug, um gegen den Strom zu schwimmen. In diesem Kontext konnten Prof. Dr. M. Engstler und Kollegen zeigen, dass nur solche Zellen im Blut des Wirtes überleben, die sich aktiv bewegen. Sie machen hierfür den hydrodynamischen Fluss verantwortlich, welcher durch die aktiven Schwimmbewegungen der Zelle erzeugt wird: Antikörper, welche an der Oberfläche von Trypanosomen gebunden haben, werden mit Fluss und somit entgegen der Schwimmrichtung zum Kopfende der Zellen getragen, wo diese aufgenommen und somit unschädlich gemacht werden können. Rückwärts schwimmende Mutanten hingegen, häufen diese Antikörper am Fußende der Zelle an, dort können diese nicht abgebaut werden und bewirken somit ihrer Aufgabe entsprechend den Abbau der Trypanosomen selbst. Um herauszufinden, ob der beschriebene Mechanismus hydrodynamisch getriebener Proteinsortierung ein einzigartiges Phänomen oder aber ein in der uns bekannten Natur weit verbreitetes Prinzip darstellt, müssen wir a priori den genauen Bewegungsablauf sowie dessen hydrodynamische Wirkung auf die Zellen verstehen.Das Ziel dieser Arbeit ist den Bewegungsablauf von Trypanosomen in ihrer mikrofluidischen Umgebung messbar zu machen und zu beschreiben, um auf diesem Wege zu klären, warum sich Trypanosomen auf welche Art und Weise bewegen. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir zunächst ein sehr lichtempfindliches Fluoreszenzmikroskop zur optischen Mikromanipulation lebender Zellen entwickelt, welches bei hoher raumzeitlicher Auflösung und hoher optischer Kraftwirkung minimale phototoxische Wirkung zeigt. In Kombination mit speziell angepassten mikrofluidischen Methoden, erlaubt dieses Instrument die Manipulation einzelner lebender Zellen, sowie die präzise Kontrolle über Strömungsbedingungen und die räumliche Umgebung im Umfeld der Zellen. Dieser Aufbau ermöglicht also nicht nur einzelne Zellen gezielt im dreidimensionalen Raum zu positionieren, sie zu bewegen und deren Kräfte zu messen, sondern auch das gezielte Markieren lebender Zellen mit Fluoreszenzmarkern im Mikrofluss, sowie die unmittelbare Beobachtung und Quantifizierung des gesamten Prozesses.In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass es möglich ist, lebende Trypanosomen über einen Zeitraum von t < 15 min mit Hilfe eines stark fokussierten Diodenlaser festzuhalten, ohne die Zellen dabei erheblich zu schädigen. Die dabei ausgeübten optischen Haltekräfte wurden bestimmt, um die Fortbewegungskräfte einzelner sowie in Teilung befindlicher Zellen zu messen. Gleichzeitig war es möglich mit Hilfe von automatisierten Bildbearbeitungsroutinen quantitativ den Ort der höchsten optischen Kraftwirkung zu bestimmen und diesen in Verbindung mit bekannten Zell Strukturen zu setzen. Nach erfolgreicher Charakterisierung der optischen Kraftwirkung auf die Zellen, wurde die Bewegung der Zellen also solche innerhalb des optischen Potentials analysiert. Dabei konnten sogenannte Läufer von Torklern getrennt und die maßgeblichen Unterschiede im jeweiligen Bewegungsablauf zeitlich hoch aufgelöst (100fps) und gleichzeitig über lange Zeiträume (5min) quantifiziert werden. Es war möglich, diese Bewegungsarten auf bestimmte Schlagmuster des Flagellums zurückzuführen und zu zeigen, dass sich diese über die Zeit ändern können. Durch den Einbau einer zweiten frei beweglichen optischen Falle war es weiterhin möglich, die Schlagkräfte zu messen, welche ein festgehaltenes Trypanosom mit Hilfe seines Flagellums auf Objekte in Reichweite ausüben kann. Durch diese Erweiterung konnten nun auch zwei Zellen gleichzeitig festgehalten und manipuliert werden, so dass untersucht werden konnte, ob die Zellen sich gegenseitig hydrodynamisch beeinflussen. Dabei hat es sich gezeigt, dass sich die Zellen bei Abständen von D > 6 µm in Ihrem Bewegungsablauf nicht beeinflussen, bei kleineren Abständen jedoch eine Synchronisation der Zellbewegung zu beobachten ist.Zusammengefasst unterstreichen diese Ergebnisse das Potential der angewendeten Methodik, sowie die Wichtigkeit dieser Forschung für das Verständnis der Zellbewegung, nicht nur am Beispiel von Trypanosoma brucei brucei, sondern auch für Effekte wie hydrodynamische Synchronisation komplexer Bewegungsabläufe von Organismen im Bereich kleiner Reynolds Zahlen. Wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, ermöglicht die Kombination aus optischer Mikromanipulation und mikrofluidischer Methodik präzise Kraftmessungen an lebenden Zellen unter genau kontrollierten Strömungsbedingungen und birgt ein großes Potential für zukünftige Forschungen im vielen Bereichen der Biophysik. | de |
| dc.description.abstracteng | Trypanosomes are single-celled bloodstream parasites and causative agents of African Sleeping Sickness in humans and Nagana disease in domestic livestock. The pathogen is transmitted by the bite of the tsetse fly and lethal to the infected host if left untreated. Eponymous for the Trypanosoma genus name (Trypanosoma: drilling body ) is the striking nature of their movement which is often described by the spiral motion of a corkscrew. However, looking at trypanosomes at high spatiotemporal resolution, we find that the way the cells move is more complex than described before and changes over time and cell. Apart from the question how trypanosomes move, we find ourselves confronted with the question why trypanosomes move at all? In this context, M. Engstler et al. have shown that active movement is essential for cells that are exposed to hostile antibodies. Hydrodynamic flow induced by active movement of the cell leads to a delocalization of antibodies that have bound to the cell surface: Antibodies exposed to the flow around a forward swimming cell are driven backwards into the flagellar pocket where they are taken up by endocytosis and rendered harmless by subsequent digestion. In contrary, a backward swimming cell is accumulating antibodies at the tip of the flagellum and gets digested itself by the host s immune system. If the described mechanism of hydrodynamic protein sorting is a ubiquitous feature in nature, it has to be proven in more detailed studies of cell motility as well as the involved hydrodynamic condition.The aim of this thesis is to study and quantify the movement of trypanosomes in their microfluidic environments in order to help understanding the mechanisms and reasons of their motility. To achieve this goal we constructed an optical trapping fluorescence microscope optimized for high spatiotemporal resolution and reduced phototoxicity. In combination with advanced microfluidic methods we were not only able to control hydrodynamic flow conditions and spatial confinement, but also to position, manipulate and measure forces on the single cell level, as well as to specifically label single living cells in the microflow.In this work we could show for the first time that using strongly focussed diode lasers it is possible to optically trap living trypanosomes over time scales of t < 15 min, without inducing significant photodamage. The optical stall forces acting on trypanosomes were determined and used to measure the propagation forces of single and dividing trypanosomes.In combination with automated image processing routines we also analyzed the positioning of trypanosomes within the optical trap and found distinct trapping loci which could be correlated to structural features of trypanosomes. | de |