Characterization of LIN-61 methyl mark binding and its function in C. elegans vulva development

Abstract

In eukaryotischen Zellen ist das Genom in Form von Chromatin verpackt. Chromatin besteht aus DNA, Histon-Proteinen (H2A, H2B, H3, H4) und Nichthiston-Proteinen. Die Organisation von DNA in verschiedene Chromatinzustände spielt nicht nur in der Aufrechterhaltung intakter Chromosomen eine herausragende Rolle, sondern auch bei zellulären Prozessen, die einen direkten Zugang zur DNA erfordern (z.B. Transkription, Replikation, DNA-Reparatur). Bei solchen Prozessen werden die entsprechenden Chromatinbereiche in einer Weise reguliert, dass sie in verschiedene Packungszustände, rangierend von stark kondensiertem Chromatin, bei dem die DNA nicht direkt oder nur schwer zugänglich ist (Heterochromatin), bis zu nicht oder nur schwach kondensiertem Chromatin (Euchromatin), überführt werden. Während in stark kondensierten Chromatinbereichen wenig bis keine Transkription stattfindet, ist die DNA in dekondensierten Chromatinbereichen gut zugänglich für Proteine der Transkriptionsmaschinerie und andere DNA-interagierende Proteine. Posttranslationale Histonmodifizierungen (PTM) und Chromatin-Effektorproteine sind wichtige Faktoren für die Regulierung und Aufrechterhaltung von verschiedenen Chromatinzuständen, indem sie den Kompaktheitsgrad des Chromatins entweder direkt (z.B. durch Chromatin-remodeling Aktivität) oder in trans durch die Rekrutierung von weiteren Chromatin-Effektorproteinen beeinflussen. Ein charakteristisches Merkmal von Heterochromatin ist die Trimethylierung des Lysin neun von Histon H3 (H3K9me3). Der H3K9me3 Modifizierung und Proteinen, die diese Histonmodifizierung erkennen und an sie binden, wird zugeschrieben, dass sie in die Chromatinkompaktierung und in die Genexpressionshemmung involviert sind. In der vorliegenden Arbeit wurden H3K9me3 bindende Proteine aus C. elegans identifiziert und untersucht. Es konnten die beiden einzigen zur malignant brain tumor (MBT) Proteinfamilie gehörenden Proteine in C. elegans, LIN-61 und MBTR-1, als H3K9me3 bindende Proteine identifiziert werden. Während für untersuchte MBT Proteine aus anderen Organismen bekannt ist, dass sie selektiv Histonsequenzen mit mono- und dimethyliertem Lysin binden, aber wenig Sequenzspezifität aufweisen, wird in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass das C. elegans MBT Protein LIN-61 sequenzspezifisch an Histonpeptide mit methyliertem Lysin neun bindet und LIN-61 darüber hinaus eine Methylierungstatus-Spezifität für mehrfach methyliertes Lysin neun (H3K9me2/me3 > H3K9me1) aufweist. In der vorliegenden Arbeit liefern pull-down Experimente mit H3K9me3-Peptid und verschieden mutierten LIN-61 Proteinen erste Erkenntnisse über Ähnlichkeiten und Unterschiede in dem Bindungsmechanismus von LIN-61 an methyliertes H3K9-Peptid im Vergleich zu anderen MBT Proteinen. Durch phänotypische Analyse von C. elegans lin-61-Mutanten wird gezeigt, dass eine Funktion von LIN-61 in der negativen Regulierung bei der Entwicklung von ektopischen Zellen der Vulva liegt. Außerdem wird ein Einfluss auf die Repression des Gens lin-3 gezeigt. LIN-13, ein weiterer Faktor, der bei der Regulation der korrekten Entwicklung von Vulvazellen eine Rolle spielt, wird als Interaktionspartner von LIN-61 identifiziert. Experimente, mit denen die Relevanz der H3K9me3-Bindungsfunktion von LIN-61 für dessen Funktion innerhalb der negativen Regulierung bei der Entwicklung von ektopischen Zellen der Vulva untersucht wurde, haben erbracht, dass die Interaktion von LIN-61 mit methyliertem H3K9 wichtig für seine Funktion innerhalb der korrekten Vulvaentwicklung ist. Außerdem wird in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass LIN-61 in C. elegans neben alleinigen Funktionen auch Funktionen hat, die redundant mit Funktionen des Heterochromatin Protein 1 (HP1) homologen Proteins HPL-2 und der H3K9 spezifischen Histon Methyltransferase MET-2 sind.