Identification and characterization of ADNP as a novel heterochromatin component

Abstract

In eukaryotischen Zellen ist die genetische Information in Form von langen, linearen DNA Molekülen im Zellkern gespeichert. Zeit- und Gewebespezifische Genexpressionsmuster werden durch die Kombination von DNA mit Proteinen manifestiert, was zu einer Struktur namens Chromatin führt. Das grundlegende, sich wiederholende Element des Chromatins ist das Nukleosom. In diesem ist die DNA um ein Oktamer von Histon-Proteinen gewunden. Die Nukleosomen wiederum sind durch Teile von Linker-DNA verbunden. DNA und Histone unterliegen chemischen Modifikationen, die mit bestimmten Chromatin-Zuständen assoziiert sind. Einige Faktoren, die diese Modifikationen erzeugen bzw. erkennen sind in den vergangenen Jahren beschrieben worden. Heterochromatin ist eine Chromatin Form, die durch Kompaktierung, transkriptionelle Inaktivität und späte Replikation in der S-Phase gekennzeichnet ist. Es ist mit Methylierung von DNA und Histonen assoziiert. Ein Kennzeichen von Heterochromatin ist die Trimethylierung von Histon H3 Lysin 9 (H3K9me3). Sie wird durch die Methyltransferase Suv39 erzeugt und von Heterochromatin Protein 1 (HP1) erkannt. HP1 existiert in Säugerzellen in drei Isoformen. Wie diese und andere Enzyme und Faktoren spezielle Chromatin-Zustände erzeugen und aufrechterhalten, ist noch nicht vollständig geklärt. Für ein besseres Verständnis von Heterochromatin-Faktoren, habe ich mit Hilfe von stabiler Isotopenmarkierung von Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) in einem H3K9me3 Pull-down-Experiment neue Interaktionspartner identifiziert. Activity dependant Neuroprotector (ADNP) war einer der Faktoren, die zuvor noch nicht im Kontext von Heterochromatin beschrieben wurden. Die Assoziation von ADNP mit H3K9me3 wurde in unabhängigen Experimenten bestätigt und der Faktor wurde näher charakterisiert. Zellbasierte und in vitro-Assays zeigten, dass ADNP nicht direkt an H3K9me3 bindet, sondern durch HP1 zu dieser Modifikation rekrutiert wird. Diese Assoziation von ADNP mit H3K9me3 konnte von allen drei Isoformen von HP1 vermittelt werden. Die Kartierung der Interaktions-Schnittstelle ergab, dass eine Bindung der HP1 chromoshadow Domäne an ein PxVxL Motiv innerhalb der ADNP Homöodomäne wesentlich an der Rekrutierung beteiligt ist. Die Mutation des PxVxL Motivs verursachte eine teilweise Delokalisierung vom Heterochromatin. Eine weitere Mutation eines ARKS Motivs, welches ebenfalls in der ADNP Homöodomäne vorhanden ist, verstärkte diesen Effekt. Es konnte jedoch nicht nachgewiesen werden, dass eine mögliche Lysinmethylierung in diesem Motiv an der HP1 Bindung beteiligt ist. Zur Untersuchung der Funktion von ADNP nutzte ich Knock-down in Zellen durch siRNA. Ich analysierte, ob ADNP typische Merkmale von Heterochromatin, wie die Verteilung von Histon-Modifikationen, die Lokalisierung von HP1 sowie die DNA-Methylierung, bestimmt. Ein Einfluss von ADNP auf diese Eigenschaften konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. In Luciferase-Reporter-Assays zeigte ADNP transkriptionelles Silencing Potenzial. Knock-down und Überexpressions-Experimente ergaben, dass ADNP spezifisch am Silencing von Major Satellite Repeats im perizentromerischen Heterochromatin beteiligt ist. Um herauszufinden, über welchen Mechanismus ADNP diese transkriptionelle Repression ausübt, sind weitere Studien erforderlich. Zusammenfassend identifizierte ich in dieser Arbeit ADNP als eine neue Komponente von perizentromerischem Heterochromatin, die von HP1 rekrutiert wird und an der Repression der Major Satellite Repeats beteiligt ist. Diese Studie hat zu einem tieferen Verständnis des Zusammenspiels von Suv39/H3K9me3/HP1 und dessen Auswirkungen auf die Chromatin-Funktion beigetragen.