Analysis of the RAB family of GTPases in C. elegans and their role in regulating neuronal membrane trafficking

Abstract

Rab GTPasen sind wichtige Regulatoren des intrazellulären Transportes. Diese sind in jedem Schritt des Membranentransportes von der Vesikelbildung bis hin zur Vesikelfusion involviert. Ihre Funktionen werden durch guanine nucleotide exchange factors (GEFs) und GTPase activating proteins (GAPs) reguliert. Im Säugergenom sind über 60 verschiedene Rab Proteine kodiert. Jede dieser Rab GTPasen lokalisiert zu spezifischen Kompartimenten in der Zelle. Die Aktivität der verschiedenen Rab GTPasen wird über Rab Kaskaden koordiniert, bei denen eine Rab GTPase die Maschinerie rekrutiert, um eine nachfolgende Rab GTPase zu aktivieren oder zu inaktivieren. Die Familie der Rabs ist sehr groß und über die meisten Rabs ist wenig bekannt. Außerdem gibt es bisher nur wenig Informationen darüber, wie die verschiedenen Rabs zusammenarbeiten. Im Gegensatz zum humanen System sind in C. elegans 28 RAB Proteine kodiert, die meist nur eine Isoform pro Rab-Mitglied haben. Die kleinere Größe der Rab Familie und die vielfältigen Möglichkeiten der genetischen Manipulation von C. elegans ermöglichten eine umfassende Analyse jedes RAB Proteins. In diesem Zusammenhang wurde das Expressionsmuster und die subzelluläre Lokalisation aller C. elegans RAB Proteine bestimmt. Die Analyse der Expressionsmuster ergab, dass die RAB Proteine in C. elegans in unterschiedlichen Geweben exprimiert werden, aber vor allem im Nervensystem. Weiterhin zeigte die subzelluläre Lokalisationsanalyse der RAB Proteine, dass sie zu spezifischen Kompartimenten lokalisieren und viele zeigten eine partielle Lokalisation zum Golgi Apparat. Da C. elegans Mutanten für 90% der rab Gene existieren, war es möglich, neue RAB Funktionen zu untersuchen. Da die meisten RAB GTPasen neuronal exprimiert werden, wurden alle rab Mutanten auf Veränderungen in Verhaltensweisen, welche durch das Nervensystem bestimmt werden, untersucht: Bewegung, Darmentleerung und Eiablage. Diese Untersuchung ergab, dass einzelne RAB GTPasen wichtige Regulatoren dieser Verhaltenweisen sind. Weiterhin wurden alle rab Mutanten mittels eines Aldicarb-Sensitivitätstests auf Defekte in der synaptischen Übertragung untersucht. Verschiedene neue RAB Proteine wurden identifiziert, die die Aldicarb-Sensitivität modulieren. Die Mutantenanalyse zeigte, dass die Mehrzahl der Tiere gesund war, obwohl einzelne rab Mutanten verschiedene Dysfunktionen des Nervensystems aufwiesen. Dies deutet drauf hin, dass die Funktion vieler Rabs in C. elegans redundant ist. Um herauszufinden, welche RAB Proteine zusammenarbeiten, wurde ein synthetischer RNAi Screen durchgeführt, in dem in jeder Rab Mutante die jedes der restlichen 27 RAB Proteine durch RNAi ausgeschaltet wurde. Diese Untersuchung ergab neue Einblicke in die höhere Ordnung des RAB Netzwerkes. Im zweiten Kapitel dieser Studie, wollten wir neue RAB Proteine identifizieren, die im Dense Core Vesicle (DCV) Signaling involviert sind. Interessanterweise zeigten rab-5 und rab-10 Mutanten Defekte in der DCV Sektretion. Zusätzlich wurden zwei Moleküle identifiziert, die eine TBC (Tre-2/Cdc16/Bub2) Domäne haben, TBC-2 und TBC-4, die als potentielle GAPs für RAB-5 bzw. RAB-10 fungieren. Schließlich haben wir eine Interaktion zwischen dem RAB-5 Effektor, Rabaptin-5 (RABN-5), und TBC-4 gefunden, die auf einen Zusammenhang zwischen RAB-5 und RAB-10 Funktion hinweist. Diese Ergebnisse deuten auf die Existenz einer neuen Rab-Ausschluß-Kaskade in der Regulation der DCV Ausschüttung hin, in der TBC-4 durch RAB-5 rekrutiert wird, was zu einer lokalen Inaktivierung von RAB-10 führt.