A Micro-scope on intracellular trafficking
Eine mikroskopische Übersicht intrazellulärer Transportprozesse
by Christian Olendrowitz
Date of Examination:2011-05-05
Date of issue:2011-05-11
Advisor:Dr. Stefan Eimer
Referee:Dr. Stefan Eimer
Referee:Prof. Dr. Holger Stark
Referee:Prof. Dr. Silvio Rizzoli
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Name:olendrowitz.pdf
Size:8.49Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The general aim of this thesis work is to gain an encompassing insight into the intracellular trafficking machinery of multicellular organisms. For this purpose, the previously well-described model organism Caenorhabdits elegans is analyzed in our studies, with a focus on the family of small Rab-GTPases. These Rab-proteins (RABs) are the central players that orchestrate all intracellular trafficking events. An introduction to the current understandings in this field of science is given in the introductory chapter I. This thesis work began with a morphological description and a behavioral characterization of mutants of all members of rab-gene (rab) family. The major technique used for this anatomic investigation on the cellular- and subcellular level was two- as well as three-dimensional electron microscopy of high-pressure frozen nematode with a near-native sample-preservation. An atlas comprising all morphological data together with the results of additional behavioral studies, is the ultimate outcome of this thesis work. Among the descriptions of several tissues and organelles, the findings that the Golgi shapes seems to adapt to the activity in a tissue-specific manner is of central importance as it suggests that intracellular transport processes must also be investigated in a tissue-specific fashion. The generated tissue- and Rab-Atlas, along with all related results, is presented in chapter III, while a detailed description of used materials and methods is given in chapter II. During the entire investigation a special focus was directed towards the ultra-fast trafficking events that ensure the transmission at synapses. To aid these studies, the image analysis tool XtraCOunt was generated during this thesis work in order to semi-automates the analysis of these trafficking studies. Chapter IV describes this tool along with all its features. In the atlas studies the rab-10 mutant was identified as potentially neuronally impaired. In chapter IV, this mutant is examined for its synaptic features and it has been found to resemble the rab-2 mutant alterations in dense-core vesicle biogenesis. XtraCOunt was conceived for the analysis of electron micrographs of nematode synapses but was shown to be applicable in a vast range of other trafficking studies. Current collaborating studies, using this tool, led to the understanding of the phenotype of Sydney Brenner's first described mutant dpy-1 (dumpy), whose cuticular components are not able to maintain their network integrity. The fundamental findings of this study are presented in chapter V. To overcome imaging-constrains presented by the mostly electron microscopic nature of my study, I have furthermore tested the possibility of studying high-pressure frozen specimen with x-rays. High resolution phase contrast imaging, holo-tomography as well as micro-fluorescence investigations were tested for their applicability, feasibility and limitations. Their underlying mathematical theory and the obtained experimental results are presented and discussed in chapter VI. The major results of these investigations is a full-worm-tomogram with subcellular resolution and a map of tissue-specific elemental distributions within worm thin-slices. The concluding chapter VII briefly summarizes the results of all performed investigations in the context with one another and their possible meaning for the intracellular trafficking community.
Keywords: intracellular trafficking electron x-ray microscopy tomography fluorescence vesicle distribution XtraCOunt GTPases Rab
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Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung eines verbesserten Verständnisses von intrazellulären Transportprozessen in multizellulären Organismen. Für diese Zwecke wurde in diesen Studien die Vorzüge des Modelorgansimus Caenorhabditis elegans benutzt um dessen Familie der Rab-GTPasen zu untersuchen, da diese kleinen GTPasesn sämtliche Transportprozesse organisieren. Diese Arbeit umfasst eine morphologische und phenotypische Beschreibung der verfügbaren Mutanten dieser Rab-Genfamilie auf zellulärer und subzellulärer Ebene in 2D und 3D, mit Hilfe von elektronen- und röntgen-mikroskopischen Methoden. Zusätzlich wurde zur Bewahrung der zellulären Ultrastruktur die Methode des Hoch-Druck-Gefrierens angewendet, da diese Methode eine instantane, native Konservierung des gesamten Wurmes ermöglicht. Eine Einführung in die Thematik des intrazellulären Transport ist gegeben in Kapitel I währen alle benutzen Methoden in Kapitel II zu finden sind. Die Ergebnisse der morphologischen Studie mit Hilfe von elektronenmikroskopischen Methoden sowie die Verhaltensstudien von den Rab-Mutanten sind in einem Rab-Atlas zusammengefasst und werden in einem frei zugänglichen Rab-Wiki der Forschungsgemeinschaft zur Verfügung gestellt. Die Ergebnisse aus allen vom Author, für diese Studie, durchgeführten und analysierten Experimenten sind in Kapitel III aufgeführt und diskutiert. Weitere Fokus wurde auf die ultra-schnellen Transportprozesse in Nervenzellen gerichtet. Für die Auswertung der Vesikel Verteilungen in Neuronen wurde hierfür das semi-automatisches Programm XtraCOunt entwickelt. Die Ergebnisse dieser Studien sind in Kapitel IV zusammengefasst und die erste Anwendung dieses vielseitigen Programmes in weiterführenden Studien wird in Kapitel V präsentiert. Zuletzt wurden erste röntgen-mikroskopische Untersuchungen für die Untersuchung von Hoch-Druck-Gefrorenen Proben ausprobiert. Diese Tests umfassen die Untersuchung in der Phasenkontrast-Bildgebung, Holotomographie und Röntgenspektroskopie. In Kapitel VI werden die zugrundeliegenden mathematisch-physikalischen Hintergründe erörtert und die vielversprechenden Ergebnisse dieser Untersuchungen präsentiert. Im abschließenden Kapitel VII werden alle die Zusammenhänge der Untersuchungen dieser Studie diskutiert und deren Beitrag zum weiteren Verständnis im Dienste der Forschungsgemeinschaft erörtert.
Schlagwörter: intrazellulärer Transport Röntgenmikroskopie Elektronenmikroskopie Vesikel GTPasen Rab