Functional analysis of mitochondrial sirtuins in C. elegans and mammalian cells
Funktionale Analyse mitochondrialer Sirtuine in C. elegans und Säugetierzellen
by Martina Wirth
Date of Examination:2010-11-09
Date of issue:2011-09-15
Advisor:Prof. Dr. Wolfgang Fischle
Advisor:Dr. Monika Jedrusik-Bode
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Fischle
Referee:Prof. Dr. Herbert Jäckle
Referee:Prof. Dr. Frauke Melchior
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Silent information regulator 2 (SIR-2) proteins, also referred to as sirtuins, are highly conserved NAD+-dependent protein deacetylases that are emerging to be important energy sensors and regulators of metabolism, stress responses and aging. The mammalian sirtuin protein family is quite complex, comprising seven members (SIRT1 to SIRT7) with different subcellular localization (nucleus, cytoplasm, and mitochondria). The mitochondrial SIRT4 remains the only mammalian sirtuin of which ADP-ribosyltransferase activity, but no NAD+-dependent deacetylase activity could be detected. SIRT4 negatively regulates insulin secretion and might be a therapeutic target for treatment of diabetes. However, this requires a better understanding of its biological and enzymatic function as well as identification of novel substrates. The simple multicellular organism C. elegans possesses only four SIR-2 variants (SIR-2.1 to SIR-2.4) that all show high sequence conservation to mammalian sirtuins. Overexpression of SIR-2.1 increases the life span of C. elegans, suggesting that these are also intriguing players in regulating longevity and in linking metabolism to aging-related processes. Whereas the majority of studies have focused on SIR-2.1, the variants SIR-2.2 and SIR-2.3, which are most homologous to mammalian SIRT4, remain by and large uncharacterized. In this PhD thesis I showed that SIR-2.2 and SIR-2.3 are also localized to mitochondria and are predominantly expressed in C. elegans tissues with high energy demand, e.g. pharynx and body wall muscles. Sir-2.2 and sir-2.3 deletion mutant worms did not exhibit an obvious phenotype under normal growth conditions. However, overexpression and loss of SIR-2.2 and SIR-2.3 resulted in increased sensitivity to oxidative stress, suggesting that both proteins function in oxidative stress responses. Using immunoprecipitation experiments in combination with mass spectrometry, I was able to identify all three mitochondrial members of biotin-dependent carboxylases, pyruvate carboxylase (PC), propionyl-CoA carboxylase (PCC) and methylcrotonyl-CoA carboxylase (MCC), as factors interacting with SIR-2.2 and SIR-2.3. The interaction was evolutionarily conserved with mammalian SIRT4 and mediated by the homologous biotin carboxylation domain, which is present in all three proteins. Mitochondrial biotin carboxylases play an important role in gluconeogenesis, amino acid catabolism, β-oxidation and ketone body formation. Since all three proteins were found to be acetylated on multiple lysine residues, their enzymatic activity might be regulated by NAD+-dependent deacetylation through mammalian SIRT4 and C. elegans SIR-2.2 and SIR-2.3. SIRT4, SIR-2.2 and SIR-2.3 did not exhibit NAD+-dependent protein deacetylase activity on PC peptides containing the conserved acetylated lysine residues K273 and K741. However, overexpression of SIRT4 specifically reduced the acetylation levels of the α-subunits of PCC and MCC, indicating for the first time that SIRT4 might be indeed a NAD+-dependent deacetylase. Overall, this study showed that C. elegans SIR-2.2 and SIR-2.3 and mammalian SIRT4 have conserved functions. Their interaction with mitochondrial biotin carboxylases indicates an important role as energy sensors and regulators of metabolic adaptation during nutrient deprivation.
Keywords: sirtuins; NAD+-dependent deaceylase; mitochondria; C. elegans; biotin-dependent carboxylases
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Silent Information Regulator 2 (SIR-2) Proteine, die auch als Sirtuine bezeichnet werden, gehören zu einer hoch konservierten Proteinfamilie NAD+-abhängiger Protein Deacetylasen. Sirtuine haben sich als wichtige Energiesensoren und Regulationsfaktoren von metabolischen, Stressresistenz- und Alterungsprozessen herausgestellt. In Säugetieren ist diese Proteinfamilie sehr komplex und umfasst sieben Varianten (SIRT1 bis SIRT7) mit unterschiedlicher subzellulärer Lokalisierung (Nukleus, Zytoplasma und Mitochondrien). Das mitochondriale Protein SIRT4 ist im Moment das einzig verbleibende mammalia Sirtuin für das eine ADP-Ribosyltransferase- aber keine NAD+-abhängige Deacetylasefunktion nachgewiesen werden konnte. SIRT4 ist ein negativer Regulator von Insulinsekretion und könnte einen neuen therapeutischen Angriffspunkt zur Behandlung von Diabetes darstellen. Dies erfordert jedoch ein besseres Verständnis der Biologie und enzymatischen Funktion, sowie die Identifizierung von neuen SIRT4 Substraten. Der einfache, multi-zelluläre Organismus C. elegans besitzt nur vier SIR-2 Varianten (SIR-2.1 bis SIR-2.4), die alle eine hohe Sequenzkonservierung zu den mammalia Sirtuinen aufweisen. Überexpression von SIR-2.1 erweitert die Lebensdauer von C. elegans, was zeigt, dass auch diese C. elegans Proteine eine interessante Rolle in der Regulierung der Lebensdauer und der Koppelung von Metabolismus mit Prozessen des Alterns spielen. Während sich der Grossteil bisheriger Studien auf die Funktion von SIR-2.1 konzentriert, sind die SIRT4 homologen Varianten SIR-2.2 und SIR-2.3 kaum charakterisiert. In dieser Doktorarbeit habe ich gezeigt, dass SIR-2.2 und SIR-2.3 auch in Mitochondrien lokalisert sind und in C. elegans überwiegend in Gewebe mit hohem Energiebedarf, wie z.B. Pharynx und Muskeln der Leibeswand, exprimiert werden. Unter Standardwachstumsbedingungen verursachen Deletionsmutationen in den Genen von sir-2.2 und sir-2.3 keinen offensichtlichen Phänotyp in Würmern. Allerdings führte Überexpression und Verlust von SIR-2.2 und SIR-2.3 zu erhöhter Sensitivität gegenüber oxidativem Stress, was darauf hinweist, dass beide Proteine in Reaktionswegen zur Abwehr von oxidativem Stress fungieren. Mit Hilfe von Immunpräzipitation und Massenspektrometrie konnte ich die drei mitochondrialen Vertreter der biotin-abhängigen Carboxylasen, nämlich Pyruvatcarboxylase (PC), Propionyl-CoA-Carboxylase (PCC) und Methylcrotonyl-CoA-Carboxylase (MCC), als Interaktionspartner von SIR-2.2 und SIR-2.3 identifizieren. Die Interaktion war evolutionär konserviert für mammalia SIRT4 und wurde durch die homologe Biotincarboxylase Domäne vermittelt, die in allen drei Proteinen vorhanden ist. Mitochondriale Biotin-Carboxylasen spielen eine bedeutende Rolle in Gluconeogenese, Aminosäure-Katabolismus, β-Oxidation und Ketonkörperbildung. Da in allen drei Proteinen multiple Lysin-Acetylierungen gefunden wurden, wird ihre enzymatische Aktivität möglicherweise durch NAD+-abhängige Deacetylierung, die durch mammalia SIRT4 und C. elegans SIR-2.2 und SIR-2.3 vermittelt wird, reguliert. SIRT4, SIR-2.2 und SIR-2.3 besaßen keine NAD+-abhängige Deacetylase Aktivität bei Peptiden von PC, die die konservierten und acetylierten Lysine K273 und K741 enthielten. Jedoch reduzierte die Überexpression von SIRT4 spezifisch die Acetylierungslevel der α-Untereinheiten von PCC und MCC, wodurch zum ersten mal gezeigt wurde, dass SIRT4 in der Tat eine NAD+-abhängige Deacetylase ist. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass C. elegans SIR-2.2 und SIR-2.3 sowie mammalia SIRT4 konservierte Funktionen haben. Ihre Interaktion mit mitochondrialen Biotin-Carboxylasen weist auf eine wichtige Rolle als Energiesensoren und Regulationsfaktoren bei der Anpassung des Stoffwechsels auf Nährstoffmangel hin.
Schlagwörter: Sirtuine; NAD+-abhängige Deacetylase; Mitochondria; C. elegans; biotin-abhängige Carboxylasen