A novel phosphatase modulating the DNA damage response and the tumor suppressor p53

Abstract

Das Genom einer jeden Zelle ist dem ständigen Einfluss schädlicher endogener und exogener Faktoren ausgesetzt. Beschädigungen der DNA und DNA-Mismatch können zu Genom Instabilität führen, einer der Hauptursachen von Krebs. Die schnelle Erkennung und Reparatur beschädigter DNA, sowie die Ausschaltung von Zellen mit irreparablen Schäden sind daher essentiell für die Erhaltung von Genom Integrität und Unterdrückung von Entartung. Diese Prozesse hängen von einer Phosphorylierungskaskade die auch Antwort auf DNA-Schaden (DNA damage response) genannt wird. Die Phosphorylierung des Histon-Proteins H2Ax an Ser139 ist einer der ersten Schritte nach Aktivierung der Kaskade und das phosphorylierte Histon γH2Ax dient als Marker für Beschädigte Bereiche des Chromatins. Eine Reihe von Kinasen initiieren das Signal am Ort der DNA-Beschädigung und vermitteln die Aktivierung von Effektor-Proteinen wie dem Tumorsuppressor p53. Aktivierung von p53 induziert das Aussetzen des Zellzyklus durch erhöhte Transkription des Cdk-Inhibitors p21 und kann Apoptose durch Transkription proapoptotischer Gene einleiten. Das Verhältnis zwischen phosphorylierten und nicht phosphorylierten Proteinen reguliert fast alle der bekannten Schritte der Antwort auf DNA-Schaden. Es ist daher zu erwarten, dass Phosphatasen eine Rolle bei der Steuerung dieser Kaskade spielen, dennoch ist nur wenig über ihre genaue Rolle bekannt. Es wurde ein high-throughput Screen mit einer siRNA-Bibliothek gegen humane Phosphatasen durchgeführt um neue Phosphatasen, die in die Antwort auf genotoxischen Stress involviert sind, zu identifizieren. Mit siRNA transfizierte U2OS Zellen, aus Osteosarkom abgeleitet mit wildtyp p53, wurden UVC Strahlung ausgesetzt um DNA-Beschädigungen hervorzurufen. Die Level von p53 und γH2Ax wurden in Zellen mit und ohne vorheriger UVC Exposition durch Imunofluoreszenz bestimmt. Auf diese Weise wurden 39 Phosphatasen identifiziert die potentiell die Antwort auf DNA-Schaden und den Tumorsuppressor p53 regulieren. Unter anderem wurde die dual specificity phosphatase 18 (Dusp18) als prominenter negative regulator von p53 identifiziert. Die Erschöpfung von Dusp18 induziert die Akkumulierung und Aktivierung von p53 und p21 in einer Reihe von Zelllinien. Knockdown von Dusp18 hatte weder eine signifikante Erhöhung an p53 Modifikationen zur Folge noch konnte eine verringerte Wechselwirkung mit dem negativen Regulator Mdm2 nachgewiesen werden. Die Induzierung von p21 ist abhängig von p53 und Chromatin Immunopräzipitation zeigte ein erhöhtes Binden von p53 an den Promotor p21 in Zellen die mit siRNA gegen Dusp18 transfiziert wurden. Bemerkenswerterweise konnte die Depletion von Dusp18 unabhängig von p53 zur Apoptose führen, jedoch insbesondere in Zellen mit wildtyp p53. Außerdem wurde die Aktivierung der Antwort auf DNA-Schaden Kaskade verstärkt, zu sehen durch die verstärkte Phosphorylierung von Chk2 und H2Ax. Untersuchung des Zellzyklus der Dusp18-depleted Zellen zeigte vermehrte Unterbrechung in G1 und S-Phase, begleitet von verringerter Proliferation dieser Zellen. Schließlich konnte gezeigt werden, dass Transfizierung mit siRNA gegen Dusp18 die Sensitivität von Tumorzellen gegen den S-Phase spezifischen genotoxischen Wirkstoff Gemcitabine erhöht. Folglich kann Depletion von Dusp18 die Proliferation von Tumorzellen hemmen und die Apoptose dieser Zellen fördern. Weiterhin kann Knockdown von Dusp18 den cytotoxischen Effekt von Therapeutika wie z.B. Gemcitabine erhöhen. Diese Ergebnisse bestätigen Dusp18 als neue Phosphatase, die für Überleben und Proliferation von Krebszellen notwendig ist, als Suppressor der Antwort auf DNA-Schaden und der p53-Kaskade ist es damit ein potentielles Target für neue Therapieansätze.