Structure and Biochemistry of otoferlin C2-domains

Abstract

Seit die Notwendigkeit von funktionellem Otoferlin für normales Hören entdeckt wurde, wird die Rolle dieses Proteins bei der Exozytose an der Inneren Haarzelle intensiv untersucht. In dieser Arbeit wurde die Kristallstruktur der N-terminalen C2-Domäne von Otoferlin, Otof-C2A, gelöst und analysiert. Otof-C2A ist eine vollständige Typ2-C2-Domäne mit 8 Beta-Faltblättern und einem relativ kurzen Top Loop 1, welcher in anderen C2-Domänen Teil der Ca2+-Bindungsregion ist. Struktur-basierte Sequenz-Alignments von Otof-C2A mit anderen C2-Domänen zeigen, dass nur eines von fünf Aspartaten, die vermutlich für die Ca2+-Bindung in C2-Domänen notwending sind, vorhanden ist. Gleichzeitig zeigen Berechnungen der Oberflächenladung eine positiv geladene mutmaßliche Ca2+-Bindungsstelle. In biochemischen und biophysikalischen Experimente hat Otof-C2A kein Ca2+ gebunden. Zusammen bestätigen die Ergebnisse dass diese Domäne kein Ca2+ bindet. Da C2-Domänen Phospholipid-bindende Domänen sind, wurde getestet, ob Otof-C2A an Liposomen mit unterschiedlichen Lipid-Zusammensetzungen bindet. Otof-C2A hat unter keiner der im Floatation Assay getesteten Bedingungen an die Liposomen gebunden. Um zu prüfen, ob die Anwesenheit der 5 erwähnten Aspartate in einer C2-Domäne für Ca2+-Bindung oder Ca2+-abhängige Phospholipidbindung ausreichen, wurde die Mutante Otof-5D-C2A kloniert. Vier Aminosäuren wurden an den Stellen, wo sie im Wildtyp-Protein gefehlt haben, durch Aspartate ersetzt. In allen biochemischen Experimenten verhielt sich die Mutante wie das Wildtyp-Protein. Wahrscheinlich verhindert die Kürze des Top Loop 1 die Ca2+-Bindung von Otof-C2A, weil die Bindungs-"tasche" unvollständig ist. Zusammengefasst zeigt Otof-C2A die Struktur einer typischen C2-Domäne, bindet jedoch kein Ca2+ oder Phospholipide. Die Funktion muss noch geklärt werden. Wir planten, auch die anderen einzelnen C2-Domänen sowie Gruppen von 2 oder 3 C2-Domänen oder das Protein in voller Länge zu expremieren und aufzureingen. Dies konnte nicht erreicht werden, da diese Proteine unlöslich oder aggregiert waren. Diese Probleme konnten weder durch andere Konstrukte mit verschiedenen Aminosäurelängen und verschiedenen Affinitätstags, noch durch einen Wechsel des Expressionssystems oder der Aufreinigungspuffer behoben werden, so dass keine biochemischen oder Strukturdaten für sie gesammelt werden konnten.