Show simple item record

Optical analysis of synaptic vesicle protein molecules during exo- and endocytosis using pH-switchable fluorescent probes

dc.contributor.advisorKlingauf, Jürgen Prof. Dr.de
dc.contributor.authorSinha, Raunakde
dc.date.accessioned2011-11-22T06:55:00Zde
dc.date.accessioned2013-01-18T14:22:05Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:17Zde
dc.date.issued2011-11-22de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B5D4-Fde
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-3156
dc.description.abstractAn konventionellen Synapsen des zentralen Nevensystems (ZNS) wird die schnelle synaptische Transmission durch die Freisetzung von Neurotransmittern durch die Ca2+-getriggerte Exozytose synaptischer Vesikel (SV) bewirkt. Nach der Exozytose müssen die Proteine auf den SV sortiert und durch kompensatorische Endozytose wieder in die Zellen aufgenommen werden, um das vorhandene Reservoir NT-gefüllter SV wiederaufzufüllen. In meiner Dissertation habe ich sowohl genetisch codierte als auch exogene pH-sensitive Farbstoffe benutzt, um sowohl den Verbleib als auch die Wiederaufnahme von SV Proteinen in Zellen optisch zu analysieren.Exozytose wird durch den Zusammenschluß energiearmer SNARE (N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) Protein-Komplexe bewirkt. Hierzu formen drei SNARE Proteine einen coiled-coil: Synaptosomal associated protein - 25 (SNAP-25), Syntaxin 1A (Syx1A) und Synaptobrevin 2 (Syb2). Es ist bis jetzt unbekannt wieviele SNARE Komplexe minimal für Priming und Fusion eines SV an ZNS Synapsen benötigt werden. Um diese Frage zu klären wurden einzelne Vesikelfusionen mit Hilfe der genetischen Probe SynaptopHluorin (SpH) optisch in Echtzeit gemessen. SpH ist ein pH-sensitives green fluorescent protein (GFP), genannt pHluorin (pHl), welches mit der luminalen Domäne des SV SNARE Syb2 fusioniert wurde. Die Fluoreszenzantworten bei SV Fusion zeigten eine quantilisierte Verteilung von SpH Molekülen in SV. Durch quantitative Einzelmolekülfluoreszenexperimente konnte gezeigt werden, dass die Größe eines Quants der Fluoreszenz eines einzelnen SpH Moleküls entsprach. Überraschenderweise konnte Überexpression von SpH in der KO-Maus die stimulierte SV Fusion auf wildtyp-Niveau reparieren. Allerdings konnten SV, welche nur eine Kopie von SpH enthielten nun nicht mehr schnell mit der Membran fusionieren. Dieser erste Teil der Studie zeigt, dass zwei Kopien von SpH und daher auch zwei SNARE Komplexe nötig und ausreichend für die Fusion von SV während der schnellen synaptischen Transmission sind.Um eine konstante Rate der synaptischen Transmission aufrecht zu erhalten, werden die Bestandteile der SV durch kompensatorisch Endozytose wieder aufgenommen und benutzt. Obwohl Clathrin-abhängige Endozytose (CME) der hauptsächliche Mechanismus für SV Recycling ist, scheint sie zu langsam zu sein um das schnelle Recycling zu erklären. Daher könnte es sein, dass ein vorsortiertes Reservoir von SV Proteinen auf der präsynaptischen Membran die erste Phase der CME unterstützt. Im zweiten Teil dieser Studie wurde die zeitliche und räumliche Dynamik dieses readily retrievable pools (RRetP) von SV-Proteinen auf der präsynaptischen Membran hippocampaler Neuronen mit einer neuen Fluoreszenzprobe gemessen. Mit Hilfe von CypHer 5E, dies ist ein neuer auf einem Cyaninfarbstoff basierdender pH-sensitiver exogener Marker, der an Antikörper gegen die luminalen Domänen von SV-Proteinen gekoppelt wurde, konnte die bevorzugte Endozytose von SV-Proteinen aus dem RRetP nach der Exozytose gezeigt werden. Die funktionelle Größe und Kapazität dieses Pools war der Größe des readily releasable pools (RRP) sehr ähnlich, was nahelegt, dass der RRetP das SV-Recycling während moderater synaptischer Aktivität aufrechterhalten kann. So können kleine konventionelle Synapsen des ZNS die Depletion synaptischer Vesikel bei niedrigen Stimulationsraten vermeiden, indem sie auf einen assemblierten Pool synaptischer Vesikelkomponenten zurückgreifen können und nicht auf neu-exozytotisierte Proteine angewiesen sind.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de
dc.titleOptical analysis of synaptic vesicle protein molecules during exo- and endocytosis using pH-switchable fluorescent probesde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedOptische Analyse synaptischer Vesikelproteine während Exo- und Endozytose mit Hilfe pH-abhängiger Fluoreszenzfarbstoffede
dc.contributor.refereeKlingauf, Jürgen Prof. Dr.de
dc.date.examination2011-05-02de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaftende
dc.subject.dnbBiologiede
dc.description.abstractengAt conventional synapses of the central nervous system (CNS), fast synaptic transmission is mediated by the release of neurotransmitters (NTs) upon Ca2+-triggered synaptic vesicle (SV) exocytosis. Upon exocytosis SV proteins have to be resorted and retrieved from the surface by compensatory endocytosis in order to replenish the pool of NT-filled SVs. For my thesis I used pH-switchable dyes, both genetically encoded as well as new exogenous ones, for optically analysing SV protein molecules necessary for fusion as well as their retrieval. Exocytosis is mediated by the assembly of low-energy SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) protein complexes formed by the coil-coiling of three SNARE proteins: Synaptosomal associated protein - 25 (SNAP-25), Syntaxin 1A (Syx1A), and Synaptobrevin 2 (Syb2). However, it is unknown how many SNARE complexes are minimally needed for SV priming and fusion at CNS synapses. To resolve this issue, single vesicle fusion events were optically measured in real time using the genetically encoded probe SynaptopHluorin (SpH), a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin (pHl) fused to the luminal domain of the SV SNARE Syb2. Fluorescence responses upon fusion displayed a quantal distribution of SpH molecules into SVs. Quantitative single molecule experiments revealed that the quantal size corresponds to single SpH molecule fluorescence. Surprisingly, when overexpressed on a genetic null background, SpH could fully rescue evoked SV fusion. However, SVs expressing only one copy of SpH were unable to rapidly fuse upon stimulation. Taken together, the first part of the study demonstrates that two copies of SpH and hence two SNARE complexes are necessary and sufficient for SV fusion during fast synaptic transmission.In order to maintain a steady-state rate of synaptic transmission the fused SV constituents are retrieved for further rounds of use by a compensatory process of endocytosis. Although clathrin-mediated endocytosis (CME) is thought to be the predominant mechanism of SV recycling, it seems too slow to account for fast recycling. Therefore, it has been suggested that a pre-sorted and pre-assembled pool of SV proteins on the presynaptic membrane might support the first phase of CME. In the second part of this study the spatial and temporal dynamics of such a readily retrievable pool (RRetP) of SV proteins at the presynaptic membrane of hippocampal neurons was monitored using a novel probe. By applying CypHer 5E, a new cyanine dye-based pH-sensitive exogenous marker, coupled to antibodies against luminal domains of SV proteins, the preferential retrieval of native SV constituents from the RRetP upon exocytosis was demonstrated. The functional size and capacity of this pool was found to closely resemble that of the readily releasable pool (RRP) of docked and primed SVs, suggesting that the RRetP can sustain SV recycling during moderate synaptic activity. Thus, the second part of the thesis demonstrates that small central synapses can avoid SV depletion in response to mild stimulation by having a preassembled pool of ready-to-go SV constituents (RRetP), which efficiently supports compensatory endocytosis to a significant degree without relying on freshly exocytosed SV constituents.de
dc.contributor.coRefereeNeher, Erwin Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeStühmer, Walter Prof. Dr.de
dc.subject.topicGöttingen Graduate School for Neurosciences and Molecular Biosciences (GGNB)de
dc.subject.gerSynaptisches Vesikelde
dc.subject.gerExozytosede
dc.subject.gerSNAREsde
dc.subject.gerEndozytosede
dc.subject.gerReadily Retrievable Poolde
dc.subject.engSynaptic vesiclede
dc.subject.engExocytosisde
dc.subject.engSNAREsde
dc.subject.engEndocytosisde
dc.subject.engReadily Retrievable Poolde
dc.subject.bk42.15de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-3251-3de
dc.identifier.purlwebdoc-3251de
dc.affiliation.instituteGöttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und molekulare Biowissenschaften (GGNB)de
dc.subject.gokfullWA 000: Biologiede
dc.identifier.ppn684837544de


Files in this item

Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record