The role of microRNAs in the p53 tumor suppressor pathway
Die Rolle von MicroRNAs in der p53 Tumorsuppressor-Weg
by Xin Zhang
Date of Examination:2010-06-22
Date of issue:2011-12-16
Advisor:Prof. Dr. Matthias Dobbelstein
Referee:Prof. Dr. Matthias Dobbelstein
Referee:Prof. Dr. Tomas Pieler
Referee:Prof. Dr. Jürgen Wienands
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
MicroRNAs (miRNAs) are a class of small, non-coding, double-stranded RNA molecules. In metazoan cells, miRNAs recognize their target mRNAs by imperfectly complementary binding, leading to translational repression or mRNA decay. Because of the importance of miRNAs in regulating cell differentiation, proliferation and apoptosis, miRNAs are implicated to be involved in human tumorigenesis. In line with this, decreased levels of global miRNA expression were observed in cancer, and increased number of specific miRNAs has been identified to function as oncogenes or tumor suppressors. As a transcription factor, p53 regulates many downstream target genes, through which it controls cell fates to maintain genomic integrity. Here, we reported that several miRNA genes (miR-192/194/215) were also p53-responsive. In cancer cells with wild type p53, they were up-regulated in response to the treatment of Nutlin-3 (a small molecule which inhibits Mdm2 and p53 interaction, resulting in p53 stabilization) or DNA damaging agents. All three miRNAs were found to be down-regulated in colon cancers relative to normal colon tissue, suggesting that they might have tumor suppressive activities. To support this, miR-192 suppressed clonogenic survival. Furthermore, miR-192/215 induced cell cycle arrest, which was at least partially dependent on p53 and p21. Overexpression of miR-191/215 in several cancer cell lines induced p53 and its target gene product p21, providing a positive feedback to the p53 pathway. Knockdown of endogenous miR-192 in A549 cells attenuated p53 and p21 activation in response to 5-fluorouracil treatment. Hence, miR-192 and miR-215 act as effectors as well as regulators of p53. Using highly parallel transfection of microRNA expression clones and subsequent high-content immunofluorescence microscopy, we further identified two miRNAs (miR-22 and miR-101) that can regulate p53. Overexpression of ectopic miR-22 suppressed p53 and p21 levels. p53 phosphorylation (Ser15 and 20) and acetylation (Lys382), in response to DNA damaging agent, were profoundly impaired by miR-22. Both Chk2 (one protein kinase which can target p53) and Sp1 (one p53 cofactor) were found to be down-regulated by miR-22. Rather than an oncogenic miRNA, miR-22 suppressed clonogenic survival and triggered G2/M arrest. In contrast to miR-22 as a negative regulator of p53, miR-101 induced p53 and its target gene products p21 and Mdm2. More strikingly, miR-101 also accumulated modified p53, which was reminiscent of mono-ubiquitinated p53. Antagonizing Mdm2-p53 interaction by Nutlin-3 or knockdown of Mdm2 abolished miR-101-induced p53 modification. Knockdown of other p53 modifiers (such as p300, CBP, HAUSP and its homologue USP47) respectively, did not phenocopy miR-101-induced p53 modification. Interestingly, knockdown of EZH2 (one target of miR-101) by one siRNA, also induced the same pattern of modified p53, although it needs to be further confirmed. Taken together, our results indicated that miRNAs constitute part of the p53 tumor suppressor network and contribute to its biological activities. These miRNAs might be novel therapeutic targets for diagnosis and treatment of human cancers.
Keywords: MicroRNA; p53; tumor suppressor
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MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse kleiner, nicht-codierender, doppelsträngiger RNA-Moleküle. In vielzelligen Organismen erkennen miRNAs ihre Ziel-mRNA durch nicht-perfektes komplementäres Binden, was zu translationaler Repression und dem Abbau der mRNA führt. Aufgrund der Bedeutung von miRNAs für die Regulation von Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose wird vermutet, dass miRNAs auch in der menschlichen Tumorentstehung involviert sind. Entsprechend wurden in Krebszellen reduzierte Level globaler miRNA-Expression beobachtet und für eine zunehmende Zahl an spezifischen miRNAs wird eine Funktion als Onkogen oder Tumorsuppressor identifiziert. Als Transkriptionsfaktor reguliert p53 viele nachgeordnete Zielgene. Durch die Aufrechterhaltung der genomischen Integrität, kontrolliert p53 dadurch das Überleben der Zellen. Hier zeigen wir, dass auch verschiedene miRNA-Gene (miR-192/194/215) p53-ansprechend waren. In Krebszellen, mit Wildtyp p53, waren diese Gene als Antwort auf Nutlin-3 Behandlung (ein kleines Molekül, welches die Interaktion zwischen Mdm2 und p53 inhibiert und dadurch p53 stabilisiert) oder DNA-schädigende Agenzien hochreguliert. Alle drei miRNAs sind im Vergleich zu normalem Dickdarmgewebe im Kolonkrebs herunterreguliert, was darauf hinweist, dass sie tumorsuppressive Aktivität aufweisen. Bestätigend, miR-192 unterdrückte klonogenes Überleben. Weiterhin induzierten miR-192/215 Zellzyklus-Arrest, was zumindest teilweise von p53 und p21 abhängig war. Die Überexpression von miR-191/215 in verschiedenen Krebszelllinien induzierte p53 und sein Zielgenprodukt p21, welches eine positive Rückkopplung zum p53 Signalweg liefert. Der Knockdown von endogener miR-192 in A549 Zellen dämpfte p53 und p21 Aktivierung als Antwort auf 5-Fluorouracil Behandlung. Daher agieren miR-192 und miR-215 als Effektoren sowie Regulatoren von p53. Durch hochparallele Transfektion von miRNA-Expressionsklonen und anschließender Hochdurchsatz-Immunfluoreszenz-Mikroskopie haben wir zwei weitere miRNAs (miR-22 und miR-101) als Regulatoren von p53 identifiziert. Überexpression von ektopischer miR-22 reduzierte die Level von p53und p21. p53-Phosphorylierung (Ser15 und 20) und -Acetylierung (Lys382) wurden in der Antwort auf DNA-schädigende Stoffe deutlich verringert. Sowohl Chk2 (eine Proteinkinase, die u.a. p53 als Substrat hat) und Sp1 (ein p53-Co-Faktor) zeigten eine Herunterregulation durch miR-22. Im Gegensatz zu einer onkogenen miRNA unterdrückte miR-22 clonogenes Überleben und verursachte einen G2/M-Arrest. Im Vergleich mit miR-22, die als Negativ-Regulator von p53 fungiert, konnte miR-101 sowohl p53 selbst als auch seine Zielgene p21 und Mdm2 induzieren. Auffallenderweise war miR-101 ebenfalls in der Lage modifiziertes p53 zu akkumulieren, wobei die Art der Modifikation auf mono-ubiquitiniertes p53 hinwies. Indem die Mdm2-p53 Interaktion durch Nutlin-3 Behandlung oder knockdown von Mdm2 antagonisiert wurde, wurde die durch miR-101-induzierte Modifizierung von p53 inhibiert. Dieser, durch miR-101 hervorgerufene, p53-Phänotyp konnte nicht durch knockdown anderer p53 Modifikatoren (wie p300, CBP, HAUSP und dessen Homologes USP47) herbeigeführt werden. Interessanterweise zeigte jedoch der knockdown von EZH2 (welches ebenfalls ein Ziel von miR-101 ist) mittels einer siRNA denselben Einfluss auf die Modifizierung von p53, wobei dies allerdings weiter bestätigt werden muss. Zusammengefasst deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass miRNAs einen Teil des p53 Tumor Suppressor Netzwerkes bilden und damit zu dessen biologischer Aktivität beitragen. Diese miRNAs könnten als neue therapeutische Ziele für die Diagnose und die Behandlung von humanen Tumorerkrankungen dienen.
Schlagwörter: MicroRNA; p53; Tumorsuppressor