The role of microRNAs in the p53 tumor suppressor pathway

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse kleiner, nicht-codierender, doppelsträngiger RNA-Moleküle. In vielzelligen Organismen erkennen miRNAs ihre Ziel-mRNA durch nicht-perfektes komplementäres Binden, was zu translationaler Repression und dem Abbau der mRNA führt. Aufgrund der Bedeutung von miRNAs für die Regulation von Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose wird vermutet, dass miRNAs auch in der menschlichen Tumorentstehung involviert sind. Entsprechend wurden in Krebszellen reduzierte Level globaler miRNA-Expression beobachtet und für eine zunehmende Zahl an spezifischen miRNAs wird eine Funktion als Onkogen oder Tumorsuppressor identifiziert. Als Transkriptionsfaktor reguliert p53 viele nachgeordnete Zielgene. Durch die Aufrechterhaltung der genomischen Integrität, kontrolliert p53 dadurch das Überleben der Zellen. Hier zeigen wir, dass auch verschiedene miRNA-Gene (miR-192/194/215) p53-ansprechend waren. In Krebszellen, mit Wildtyp p53, waren diese Gene als Antwort auf Nutlin-3 Behandlung (ein kleines Molekül, welches die Interaktion zwischen Mdm2 und p53 inhibiert und dadurch p53 stabilisiert) oder DNA-schädigende Agenzien hochreguliert. Alle drei miRNAs sind im Vergleich zu normalem Dickdarmgewebe im Kolonkrebs herunterreguliert, was darauf hinweist, dass sie tumorsuppressive Aktivität aufweisen. Bestätigend, miR-192 unterdrückte klonogenes Überleben. Weiterhin induzierten miR-192/215 Zellzyklus-Arrest, was zumindest teilweise von p53 und p21 abhängig war. Die Überexpression von miR-191/215 in verschiedenen Krebszelllinien induzierte p53 und sein Zielgenprodukt p21, welches eine positive Rückkopplung zum p53 Signalweg liefert. Der Knockdown von endogener miR-192 in A549 Zellen dämpfte p53 und p21 Aktivierung als Antwort auf 5-Fluorouracil Behandlung. Daher agieren miR-192 und miR-215 als Effektoren sowie Regulatoren von p53. Durch hochparallele Transfektion von miRNA-Expressionsklonen und anschließender Hochdurchsatz-Immunfluoreszenz-Mikroskopie haben wir zwei weitere miRNAs (miR-22 und miR-101) als Regulatoren von p53 identifiziert. Überexpression von ektopischer miR-22 reduzierte die Level von p53und p21. p53-Phosphorylierung (Ser15 und 20) und -Acetylierung (Lys382) wurden in der Antwort auf DNA-schädigende Stoffe deutlich verringert. Sowohl Chk2 (eine Proteinkinase, die u.a. p53 als Substrat hat) und Sp1 (ein p53-Co-Faktor) zeigten eine Herunterregulation durch miR-22. Im Gegensatz zu einer onkogenen miRNA unterdrückte miR-22 clonogenes Überleben und verursachte einen G2/M-Arrest. Im Vergleich mit miR-22, die als Negativ-Regulator von p53 fungiert, konnte miR-101 sowohl p53 selbst als auch seine Zielgene p21 und Mdm2 induzieren. Auffallenderweise war miR-101 ebenfalls in der Lage modifiziertes p53 zu akkumulieren, wobei die Art der Modifikation auf mono-ubiquitiniertes p53 hinwies. Indem die Mdm2-p53 Interaktion durch Nutlin-3 Behandlung oder knockdown von Mdm2 antagonisiert wurde, wurde die durch miR-101-induzierte Modifizierung von p53 inhibiert. Dieser, durch miR-101 hervorgerufene, p53-Phänotyp konnte nicht durch knockdown anderer p53 Modifikatoren (wie p300, CBP, HAUSP und dessen Homologes USP47) herbeigeführt werden. Interessanterweise zeigte jedoch der knockdown von EZH2 (welches ebenfalls ein Ziel von miR-101 ist) mittels einer siRNA denselben Einfluss auf die Modifizierung von p53, wobei dies allerdings weiter bestätigt werden muss. Zusammengefasst deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass miRNAs einen Teil des p53 Tumor Suppressor Netzwerkes bilden und damit zu dessen biologischer Aktivität beitragen. Diese miRNAs könnten als neue therapeutische Ziele für die Diagnose und die Behandlung von humanen Tumorerkrankungen dienen.