Kristallographische Untersuchungen zur Schweren Kette von Dynein und dem Capping-Protein Cap32/34

Abstract

Bewegungsvorgänge in Zellen sind fundamentale Prozesse, ohne die intrazellulärer Material-Transport, Zellteilung oder Nahrungsaufnahme nicht möglich wären. Diese können auf zwei verschiedene Arten vermittelt werden. Einerseits durch Motorproteine wie Dynein, Kinesin und Myosin, die die in ATP gespeicherte chemische Energie in gerichtete Bewegung umsetzen, um beispielsweise Organellen entlang von Mikrotubuli- oder Aktinfilamenten zu transportieren. Zum anderen durch die Polymerisation von Aktin oder Tubulin zu polarisierten Filamenten, wodurch ebenfalls unter ATP-Verbrauch gerichtete Bewegung generiert wird. Hierfür ist die präzise Regulation der Filamente, z.B. des F-Aktins durch Aktin-bindende Proteine wie das Capping-Protein (CP), von zentraler Bedeutung. Der erste Teil dieser Arbeit fokussierte sich auf die strukturelle Charakterisierung der Schweren Kette (DHC) des Mikrotubuli-assoziierten Motorproteins Dynein von Mensch und Dictyostelium discoideum mittels Röntgenstrukturanalyse. Die DHC gehört mit einer molekularen Masse von ca. 520 kDa zu den größten Proteinen in eukaryotischen Zellen. Bedingt durch ihre Größe, konnte bisher nur ein kleiner Bereich der Schweren Kette in atomarer Auflösung beschrieben werden. Um Protein in für die Kristallisation ausreichenden Mengen zu erhalten, wurde die DHC systematisch in kleinere Abschnitte unterteilt und die Konstrukte im niederen Eukaryoten Dictyostelium discoideum exprimiert. Insgesamt gelang es, zahlreiche Teilbereiche der DHC in hoher Ausbeute zu produzieren. Für zwei Konstrukte, die jeweils entscheidende Domänen für die Krafterzeugung enthielten, konnten Kristalle erhalten werden. Allerdings beugten diese auch nach intensiven Optimierungsversuchen nur schwach und genügten daher nicht der atomaren Strukturaufklärung. Im zweiten Teil dieser Arbeit gelang es, mit bakteriell exprimiertem Cap32/34 von Dictyostelium discoideum zum ersten Mal die Kristallstruktur eines zytoplasmatischen Capping-Proteins aufzuklären. Die Struktur wurde bei einer Auflösung von 2.2 Å röntgenkristallographisch mit der Methode des Molekularen Ersatzes gelöst. Das Heterodimer zeigt eine pilzähnliche Struktur, bestehend aus einer stiel- und einer hutförmigen Komponente. Trotz einer nur geringen Sequenzidentität, besitzen die beiden Untereinheiten sehr ähnliche Sekundär- und Tertiärstrukturen, wodurch das Cap32/34 Molekül eine pseudo-zweifache Rotationssymmetrie besitzt. Vergleiche mit der Kristallstruktur von spezifisch im Muskelgewebe vorkommendem CP (GgCapZ) deckten zwei signifikante Unterschiede zwischen den Isoformen auf, deren Gesamtstrukturen sich als hoch konserviert herausstellten. Eine basische Loop-Region, die in Cap32/34 aufgrund stark ausgeprägter Flexibilität nicht in das Strukturmodell integriert werden konnte, liegt in GgCapZ hoch geordnet vor. Dies lässt vermuten, dass das Proteinsegment in Cap32/34 und potenziell in allen zytoplasmatischen Capping-Proteinen in die Interaktion mit negativ geladenen Bindungspartnern involviert ist. Mögliche Kandidaten wären F-Aktin und Phospholipide. Ferner zeigte der Strukturvergleich, dass sich die CP-Varianten in einer weiteren Schleifenregion deutlich unterscheiden, sowohl in struktureller Hinsicht als auch in Bezug auf die ihnen zugrunde liegenden Flexibilitätsgrade. In GgCapZ ist das Segment durch einen wesentlich höheren Temperaturfaktor charakterisiert und könnte aufgrund seiner Lösungsmittelzugänglichkeit an der Interaktion mit der Z-Scheibe des Sarkomers beteiligt sein, an der das Protein spezifisch lokalisiert ist.