Structural and functional investigation of the protein synthesis in saccharomyces cerevisiae

Abstract

Proteinbiosynthese ist ein essentieller Prozess aller Zellen. Sie folgt stets dem gleichen Konzept in allen Organsimen: der genetische Code wird entschlüsselt und transkribiert, die entstandene mRNA wird wiederum in ein Polypeptid translatiert. Dieser Teilprozess wird durch das Ribosom bewerkstelligt. Die Translation umfasst wiederum mehrere Schritte: Initiation, Elongation, Termination und Ribosom Recycling. Diese Teilprozesse unterscheiden sich zum Teil stark voneinander. Ein sehr bedeutender Punkt ist der komplexe Initiationsschritt bei Eukaryonten, der die konzertierte Interaktion von mehreren Proteinen, genannt eukaryontische Initiationsfaktoren (eIF), erfordert. Der grösste Initiationsfaktor, eIF3, setzt sich aus vielen verschiedenen Untereinheiten zusammen. Dieser Komplex dient als Andockhilfe für andere Initiationsfaktoren, die noch binden werden. eIF3 forciert mRNA Rekrutierung und Assemblierung von anderen Initiationsfaktoren an der 40S ribosomalen Untereinheit. Die Komplexizität sowie flexiblen Eigenschaften dieses Faktors verhindert eine einfache Aufreinigung aus Zellen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein Protokoll zu etablieren, womit die Aufreinigung von rekombinantem eIF3 aus Saccharomyces cerevisiae möglich ist (siehe Kapitel 2). Zudem sollte die in vitro Assemblierung von recombinant aufgereinigtem eIF3 etabliert werden. Der erhaltene Komplex wurde mit Hilfe von single particle Elektronenmikroskopie auf seine Struktur analysiert. Erste Ergebnisse konnten die Position von eIF3 an der 40S Ribosomuntereinheit zeigen. eIF3 bindet an die zur Lösung hin orientierten Oberfläche. In Kombination mit limitierter Protolyse sowie Massenspektrometrie erlaubte die in vitro Rekonstitution von eIF3 die Analyse der verschiedenen Subkomplexe sowie des Kernkomplexes von eIF3. Zusätzlich konnte durch Fluoreszenzmarkierung von eIF3 eine alternative Strategie aufgezeigt werden, die kinetische Studien während der Initiation und Komplexbildung erlaubt. Eine der grossen Untereinheiten von eIF3, eIF3b/Prt1, dient als Gerüst innerhalb von eIF3 und interagiert mit anderen Untereinheiten. Es beherbergt ein non-kanonisches RNA Recognition Motif (RRM), welches nicht mit Oligonukleotiden interagiert, sondern mit eIF3j/Hcr1, eine sub-stöchiometrische Untereinheit von eIF3. In Kapitel 3 ist die Struktur von eIF3b RRM aus Saccharomyces cerevisiae hochaufgelöst abgebildet. Die Struktur zeigt die gleiche Faltung wie das menschliche Äquivalent. Thermodynamische Analysen der Interaktion zwischen Hefe eIF3b-RRM und eIF3j sowie die Konservierung des Bindemotivs suggerieren, dass sowohl in Hefe als auch im Menschen die gleiche molekulare Interaktion stattfindet. Ein wesentlicher Unterschied zwischen Hefe- und humanem eIF3b-RRM konnte durch Analyse des Ladungszustands der Oberfläche gezeigt werden. Im Gegensatz zu humanem eIF3b-RRM scheint demnach das Hefeprotein sehr wohl in der Lage zu sein, Oligonukleotide zu binden. Bindungsstudien mit total RNA Extrakt aus Hefe konnte diese Hypothese verifizieren: eIF3b-RRM aus Saccharomyces cerevisiae ist in der Lage, RNA zu binden. eIF3j/Hcr1 ist eine lose assoziierte Untereinheit von eIF3 und wurde in der Vergangenheit als Interkationspartner von Rli1 identifiziert, einem Eisen-Schwefel Cluster Protein aus der Superfamilie der ABC ATPasen. Zusätzlich zur Initiation spielt Rli1 eine wichtige Rolle in Ribosomenmaturierung sowie Transport von ribosomalen Untereinheiten in das Cytosol. In Kapitel 4 wird eine neue Funktion von Rli1 in der Translationstermination präsentiert. Es konnte nachgewiesen werden, das Rli1 mit den Terminationsfaktoren eRF1/Sup45 und eRF3/Sup35 aus Saccharomyces cerevisiae interagiert. Mit Hilfe von Deletionsstämmen für Rli1 und sup35-21 oder sup45-2 konnte die Interaktion auf genetischer Ebene gezeigt werden. Zudem konnte ein Zusammenhang zwischen der Runterregulation der Rli1 Expression und der Erkennung von Stopcodons während der Translationstermination nachgewiesen werden. Der gleiche Phänotyp tritt bei Mutationen in Terminationsfaktoren auf, weswegen ein unmittelbarer Zusammenhang bestehen zu scheint. In Kapitel 5 werden die Ergebnisse der verschiedenen Projekte diskutiert. Zudem wird ein breiter Zusammenhang mit dem aktuellen Stand der Forschung erörtert und die Bedeutung der hier vorgestellten Ergebnisse unterstrichen. Ein Ausblick auf naheliegende Projekte sowie Vorschläge für weitere Experimente werden abschliessend in Kapitel 6 ausführlich behandelt.