Functional Analysis of the Dynein Light Chain Genes, <i>Dnali1</i> and <i>Tcte3</i>

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von zwei murinen Genen Dnali1 und Tcte3 untersucht. Das Dnali1 Gen gehört zur Familie der Dyneine und kodiert für eine leichte Kette der inneren Dynein-Arme. In immunhistologische Untersuchungen kann Dnali1 entlang der gesamten Spermatozoenflagelle bzw. entlang der trachealen Zilie nachgewiesen werden. Zudem konnte Dnali1 in Zilien epithelialer Zellen in den Gehirnventrikel detektiert werden. Insgesamt deuten diese Befunde darauf hin, dass Dnali1 ein integraler Bestandteil des Axonems ist. Allerdings belegen Analysen des murinen und humanen Dnali1 Gens eine Expression in Geweben, denen ziliäre Strukturen fehlen, was auf eine mögliche Rolle von Dnali1 auch als Bestandteil bestimmter cytoplasmatischer Dyneinkomplexe hinweist. Entsprechende Experimente zur Lokalisation von Dnali1 und Dnchc1 in murinen Neuroblastoma- und embryonalen Zellen unterstützen diese Vermutung. Weitergehende Yeast-Two-Hybrid und Immunprezipitations-Experimente konnten tatsächlich eine Interaktion zwischen Dnali1 und dem C-terminalen Bereich der schweren cytoplasmatischen Dyneinkette belegen. Um nun die Funktion von Dnali1 in vivo zu untersuchen wurde das Gen mit Hilfe der homologen Rekombination in der Maus inaktiviert. Dnali1 heterozygot-defiziente Tiere sind fertil und zeigen keine phänotypischen Auffälligkeiten. Allerdings konnten aus Paarungen heterozygoter Tiere keine Dnali1-defizienten Nachkommen erzeugt werde. Weitere Untersuchungen zeigten, dass Dnali1-defiziente Embryonen bereits kurz nach der Implantation absterben. Die Ursache für diese embryonale Letalität wurde mittels in vitro Kultivierung der Embryonen untersucht. Hierbei zeigte sich, dass zwar eine Differenzierung der trophoectodermalen Zellen des Embryos erfolgte, dass aber eine Differenzierung der Embryoblastzellen unterblieb. Hierfür ist von Bedeutung, dass Dnali1 wahrscheinlich mit dem Golgi-Apparat in einer Mikrotubuli-unabhängigen Weise interagiert. Dnali1 könnte für die Organisation und korrekte Funktion des Golgi-Apparates in der frühen Embryonalentwicklung benötigt werden, wahrscheinlich als Komponente des cytoplasmatischen Komplexes.Das Tcte3 Gen kodiert für eine axonemale leichte Kette der äußeren Dyneinarme, allerdings ist Tcte3 auch Bestandteil bestimmter cytoplasmatischer Dyneinkomplexe. Um die Funktion des Gens zu untersuchen und seine Bedeutung für die Spermatogenese zu klären, sollte das Gen mit Hilfe der homologen Rekombination in der Maus inaktiviert werden. Es konnten heterzygote Tiere gewonnen werden. Allerdings gelang es mit Hilfe der PCR-Technik nicht Tiere zu identifizieren, die defizient für Tcte3 waren. Weitergehende Untersuchungen belegten, dass es mehr als eine Kopie des Tcte3 Gens im Genom der Maus gibt. Unklar blieb, inwieweit die zusätzlichen Kopien tatsächlich aktiv sind, oder ob es sich hierbei um Pseudogene handelt. Zur weiteren Klärung wurden quantitative PCR-Analysen durchgeführt. Hierdurch konnten Männchen identifiziert werden, die homozygot für das rekombinante Allel waren. In diesen Tieren war die Expression von Tcte3 im Testis auf RNA und Protein Ebene nicht nachweisbar. Zu dem waren die Männchen infertil, wobei neben einer erhöhten Anzahl an toten Keimzellen verschiedene Defekte in den reifenden Spermatiden beobachtet wurden. Offensichtlich hat Tcte3 eine wichtige Funktion bei der männlichen Keimzelldifferenzierung.