Navigation ▼

Show simple item record

dc.contributor.advisor Klingauf, Jürgen Prof. Dr. de
dc.contributor.author Kochubey, Olexiy de
dc.date.accessioned 2006-02-20T06:55:16Z de
dc.date.accessioned 2013-01-18T14:28:32Z de
dc.date.available 2013-01-30T23:50:19Z de
dc.date.issued 2006-02-20 de
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B5E7-5 de
dc.description.abstract Nach dem Andocken an die Plasmamembran bereiten sich sekretorische Bläschen (Vesikel) in mehreren Schritten auf ihre Ca2+-abhängige Fusion vor. Die molekularen Vorgänge, die sich zwischen dem ersten morphologischen Kontakt mit der Membran und dem Erreichen des fusionsfähigen ( primed ) Zustands abspielen, sind bisher noch ungeklärt. In dieser Arbeit wurde die Totalreflektionsmikroskopie (TIRFM) verwendet, um in Echtzeit einzelne fluoreszenzmarkierte Large Dense Core -Vesikel (LDCV) an der Plasmamembran intakter Nebennieren-Chromaffinzellen zu beobachten. Die TIRFM-Bildgebung wurde mit dem Verfolgen individueller Partikel und mit einer Korrelations- und Aufenthaltszeitanalyse kombiniert, als auch durch stochastisches Modellieren ergänzt, um die molekularen Vorgänge während des Vesikel-Andockens besser zu charakterisieren. Als Modellsystem wurden Zellen von munc18-1 null-mutanten Mäusen verwendet, da dieses t-SNARE Syntaxin-1a-bindende Protein essentiell für das Andocken und die Fusion von Vesikeln ist.Die durch TIRFM-Messungen bestimmete Dichte NPY-Venus-markierter LDCV in den Zellabdrücken spiegelte Veränderungen beim morphologischen Andocken und bestätigte EM-ultrastrukturelle Unterschiede zwischen munc18-1 Null (M18 KO), Wildtyp (WT) und Null+Munc18-1 (Rescue-) Zellen. Eine Analyse der axialen Zitterbewegung gedockter LDCV durch eine Geschwindigkeits-Autokorrelatonsfunktion zeigte eine eindeutige negative Autokorrelationskomponente für kurze t ~0.5-1 s auf, die in M18 KO-Zellen 4-5 mal kleiner war als in WT-Zellen. Die negative Autokorrelations-Amplitude (NPA) konnte bei Rescue-Zellen vollständig und bei Zellen, die mutiertes Munc18-1D34N;M38V mit einer niedrigen Affinität zu Syntaxin-1a oder Munc18-2 überexprimieren, teilweise wiederhergestellt werden. Bei M18 KO-Zellen konnte der Phorbolester PMA das Andocken und die Sekretion wiederherstellen, die NPA hingegen blieb klein. Computer-Simulationen der LDCV Bewegung ergaben, daß die NPA durch die auf das freie Diffusionsmodell angewendete Einschränkungen bestimmt wird. Eine kleine NPA kann entweder auf eine stark eingeschränkte Bewegung durch Käfigbildung oder Bindungskräfte, oder auf eine nahezu freie Diffusion mit nur schwachen Einschränkungen zurückgeführt werden. Da die Bindungskräfte von der Aktin-Zytomatrix bereitgestellt werden könnten, die in M18 KO-Zellen verdickt ist, wurde die Auswirkung einer pharmakologischen Aktin-Depolymerisation auf die NPA untersucht. Die Entfernung des Aktin-Kortex führte zu einer Wiederherstellung des morphologischen Andockens in M18 KO-Zellen bei unveränderter NPA oder Sekretion und deutet so auf ein schwaches und nicht-funktionelles Binden/Andocken der Vesikel in M18 KO-Zellen hin. Um die Aufgabe von SNAREs aufzuklären, wurden SNAP-25A null-mutante Zellen untersucht und eine Neurotoxin-vermittelte Spaltung von SNAREs durchgeführt. Nur die Überexpression der leichten Kette von BoNT-C1 verringerte die NPA. Durch Entwicklung und Anwendung einer automatisierten Analyse der Vesikel-Aufenthaltszeiten an der Membran konnte gezeigt werden, dass sich annähernde Vesikel nur selten andocken und nur einige dieser Besucher durch mindestens zwei verschiedene Bindungsarten eingefangen werden, die eine niedrige oder eine hohe Affinität aufweisen. Munc18-1 vergrößerte sowohl die Population des letzteren Zustands, als auch die Gesamtrate mit der Vesikel zugeführt werden.Schlußfolgernd konnten drei verschiedene Andockzustände identifiziert werden, in denen andockende Vesikel entweder sofort wieder abkoppeln oder durch minimale Andock/Bindungsprinzipien eingefangen und in einen Munc18-1/Syntaxin-abhängigen, fest gebunden, fusionsbereiten Zustand konvertiert werden. de
dc.format.mimetype application/pdf de
dc.language.iso eng de
dc.rights.uri http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html de
dc.title Probing modes of vesicle docking in neurosecretory cells with evanescent wave microscopy de
dc.type doctoralThesis de
dc.title.translated Untersuchung zur Vesikel-Andockmodi in neurosecretorischen Zellen mit Totalreflektionsmikroskopie de
dc.contributor.referee Neher, Erwin Prof. Dr. de
dc.date.examination 2006-01-18 de
dc.subject.dnb 500 Naturwissenschaften de
dc.description.abstracteng Secretory vesicles dock at the plasma membrane and proceed through several steps in preparation for Ca2+-triggered fusion. The molecular events between the first morphological contact with the membrane and primed state are poorly understood. In this work, total internal reflection microscopy (TIRFM) was used for real-time imaging of single fluorescently labeled large dense core vesicles (LDCVs) beneath the plasma membrane of intact adrenal chromaffin cells. TIRFM imaging was combined with the single particle tracking, correlation and residency time analysis, and assisted by stochastic modeling, to better characterize molecular events in vesicle docking. Cells from munc18-1 null mutant mice were chosen as a model system since this t-SNARE Syntaxin-1a interacting protein is known to be essential for vesicle docking and fusion.Footprint density of NPY-Venus labeled LDCVs, measured with TIRFM, was found to reflect alterations in morphological docking, confirming EM ultrastructural differences in munc18-1 null (M18 KO) vs. wildtype (WT) and null+Munc18-1 (Rescue) cells. Analysis of the jittering movement of docked LDCV in axial direction by the velocity autocorrelation function revealed a distinct negative autocorrelation component at small t ~0.5-1 s, which was 4-5 times smaller in M18 KO cells than in WT. The negative autocorrelation amplitude (NPA) was restored in Rescue cells and partially recovered by overexpressing mutated Munc18-1D34N;M38V with low affinity for Syntaxin-1a or Munc18-2. Phorbol ester PMA rescued docking and secretion in M18 KO cells, but the NPA remained small. Computer simulations of LDCV movement showed that the NPA is determined by restrictions applied to the free diffusion model. The small NPA can be attributed to either strongly restricted movement by encagement or tethering forces, or early free diffusion with weak restrictions. Since the tethering could be provided by the actin cytomatrix, thickened in the M18 KO cells, the effect of pharmacological actin depolymerization on the NPA was examined. Actin cortex removal led to restoration of morphological docking in M18 KO cells without altering the NPA or secretion, suggesting weak and non-functional tethering/docking of vesicles in M18 KO cells. The role of SNAREs in docking was probed in SNAP-25A null mutant cells and by neurotoxin-mediated cleavage of SNAREs: only BoNT-C1 light chain overexpression reduced the NPA. By developing and using an automated analysis of vesicle residency time at the membrane, approaching vesicles were shown to infrequently dock with only some visitors being captured by at least two different tethering modes, low and high-affinity. Munc18-1 increased the population of the latter state as well as the overall vesicle delivery rate.In conclusion, three distinct docking states were identified where docking vesicles either undock immediately or are captured by minimal docking/tethering principles and converted into a Munc18-1/Syntaxin-dependent, tightly tethered, fusion competent state. de
dc.contributor.coReferee Moser, Tobias Dr. de
dc.subject.topic Molecular Biology & Neurosciences Program de
dc.subject.ger sekretorische Vesikel de
dc.subject.ger Andocken de
dc.subject.ger Exocytosis de
dc.subject.ger Chromaffinzellen de
dc.subject.ger Munc18 de
dc.subject.ger Totalreflektionsmikroskopie de
dc.subject.ger einzelne Vesikel Verfolgung de
dc.subject.eng secretory vesciles de
dc.subject.eng vesicle docking de
dc.subject.eng exocytosis de
dc.subject.eng chromaffin cells de
dc.subject.eng Munc18 de
dc.subject.eng evanescent wave microscopy de
dc.subject.eng single vesicle tracking de
dc.subject.bk 42.12 de
dc.subject.bk 42.15 de
dc.identifier.urn urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-663-7 de
dc.identifier.purl webdoc-663 de
dc.affiliation.institute Göttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und molekulare Biowissenschaften (GGNB) de
dc.subject.gokfull WC 100: Biophysikalische Methoden de
dc.subject.gokfull WHC 100: Zellmembranen de
dc.subject.gokfull Zelloberfläche de
dc.subject.gokfull Zellwand de
dc.subject.gokfull intrazelluläre Membranen {Cytologie} de
dc.identifier.ppn 515223166 de

Files in this item

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record