Characterization of neuronal SNAREs and interacting proteins

Abstract

Diese Arbeit konzentrierte sich auf die SNARE-Proteine Syntaxin 1, SNAP-25 und Synaptobrevin 2, die an der Freisetzung von Neurotransmittern aus synaptischen Vesikeln mitwirken. Ein einfaches Modell vergleicht die Funktionsweise von SNAREs mit einem Reissverschluss, wobei man annimmt, dass sie sich ausgehend vom N-Terminus zu einem Bündel zusammenlagern. Wahrscheinlich reicht die dabei freigesetzte Energie zur Aktivierung der Vesikelfusion aus. Allerdings sind die Belege für das Reissverschluss-Modell weitgehend indirekt.In vivo werden die Neurotransmitter innerhalb von Millisekunden freigesetzt, wenn man aber neuronale SNAREs in Liposomen einbaut, benötigt deren Fusion mehrere Minuten. Dieser Widerspruch beschäftigt die Forschung schon seit längerem und war Grundlage für den ersten Teil dieser Arbeit. Durch biochemische Analyse wurde die schrittweise Ausbildung des neuronalen SNARE-Komplexes nachgewiesen. Zuerst entsteht ein dimerer Übergangskomplex aus Syntaxin 1 und SNAP-25, an den Synaptobrevin binden kann, jedoch auch ein zweites Molekül Syntaxin 1. Ein 2:1 Komplex aus Syntaxin 1 und SNAP-25 ist für Synaptobrevin nicht zugänglich und daher der Reaktion zum neuronalen SNARE-Komplex entzogen. Zu Beginn der Arbeit vermuteten wir, dass die Bildung des 2:1 Komplexes die Liposomenfusion verlangsamt. Dazu wurde ein trimerer Komplex aus Syntaxin 1, SNAP-25 und einem C-terminalen Teil von Synaptobrevin untersucht, dessen Struktur dem Dimer aus Syntaxin 1 und SNAP-25 ähnelt, an den aber kein weiteres Syntaxin 1 binden kann. Wurde der trimere Komplex in Liposomen eingebaut, erfolgte deren Fusion deutlich schneller. SNAREs können daher schnelle Membranfusion vermitteln, wenn der dimere Übergangskomplex stabilisiert wird. Meine Daten belegen ausserdem, dass Synaptobrevin an den N-terminalen Teil der Q-SNAREs bindet, was mit dem Reissverschluss-Modell übereinstimmt.Der übrige Teil der Arbeit beschäftigte sich mit den löslichen, regulatorischen SNARE-Proteinen Tomosyn und Amisyn. Beide Proteine bilden einen stabilen trimeren Komplex mit Syntaxin 1 und SNAP-25. Aus der sorgfältigen Charakterisierung des SNARE-Motivs von Tomosyn ergab sich die Aufklärung der Kristallstruktur des SNARE-Kernkomplexes um Tomosyn, der wie der neuronale Komplex ein Bündel aus vier Helices darstellt. Tomosyn kann im Komplex nicht durch Synaptobrevin ersetzt werden, und die Hinweise aus meiner Arbeit bestärken die Annahme, dass Tomosyn und Amisyn als Inhibitoren der Exocytose wirken könnten.