SNARE assembly and regulation on membranes

Abstract

Die Fusion synaptischer Vesikel mit der präsynaptischen Plasmamembran wird durch sogenannte SNARE-Proteine vermittelt. Die vorliegende Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis des Verhaltens des vesikelständigen SNARE-Proteins Synaptobrevin, sowohl in seiner nativen Organelle als auch in Liposomen rekonstituiert, bei. Die Reaktivität rekonstituierten Synaptobrevins ist bislang umstritten. So legten kürzlich durchgeführte Studien nahe, dass membranständiges Synaptobrevin nicht effizient in SNARE-Komplexe eingebaut wird (Hu et al., 2002; Kweon et al., 2003b). Deshalb habe ich die Bindungseigenschaften und die SNARE-Komplexbildungsreaktion auf Synaptobrevin exponierenden Membranen untersucht. So wie die lösliche Dömane bindet membranassoziiertes Synaptobrevin den SNAP-25/Syntaxin-Akzeptorkomplex, was zur Bildung eines stabilen, tetrahelikalen SNARE-Bündels führt. Kinetiksimulationen und Anpassung experimenteller Daten trugen dazu bei, den Reaktionsweg der SNARE-Komplexbildung auf Membranen aufzuklären. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen weisen darauf hin, dass es sich um eine robuste Reaktion handelt, die von den meisten endogenen und äußeren Faktoren wie Hirnzytosol, Membranfluidität, Chaotropizität, divalenten Ionen und der Lipidkomposition weitgehend unbeeinflusst bleibt, jedoch durch Anwesenheit schwacher Gegenionen signifikant verstärkt wird. In Einklang mit dieser Beobachtung ist auch die Einbaurate von in Liposomen rekonstituiertem Synaptobrevin in SNARE-Komplexe mit der auf synaptischen Vesikeln vergleichbar. Aufgrund ihrer hohen Reaktivität ist die Regulation von SNARE-Proteinen von hoher Bedeutung. Es ist gezeigt worden, dass Synaptobrevin in Membranen assoziiert an das Vesikelprotein Synaptophysin vorliegt, welches potentiell als SNARE-Regulatorprotein fungiert. Hier konnte ich zeigen, dass die Bindung von Syntaxin/SNAP-25 an Synaptobrevin in der Lage ist, dessen Assoziation an Synaptophysin aufzuheben.Drei monoklonale Antikörper, die sich gegen den ternären SNARE-Komplex nicht jedoch gegen die SNARE-Monomere richten, wurden erfolgreich hergestellt und mithilfe von Immunoblotting, Zellinien und Plasmamembran- Sheets charakterisiert. Ihre Bindungsstellen konnten kartiert werden. Desweiteren waren die Antikörper in der Lage, SNARE-Komplex-dissoziation in einem funktionellen Experiment zu inhibieren und können damit Einblick in die Dissoziationsmaschinerie geben. Auch könnte ihr Einsatz in anderen funktionellen Untersuchungen helfen, noch ausstehende Fragen zu beantworten. Außerdem wurden der Zustand sowie die Dynamik von SNARE-Komplexen in präsynaptischen Nervenendigungen untersucht. Dabei konnte ich zeigen, dass die SNARE-Komplexmengen in ruhenden und stimulierten Synaptosomen vergleichbar sind, was darauf hinweist, dass diese schnell wieder dissoziiert werden, sobald Exozytose stattgefunden hat. Einige SNARE-Komplexe konnten jedoch auf isolierten Organellen mittels Mikroskopie und Immunoblotting detektiert werden. Dieses könnte ein Hinweis darauf sein, dass Komplexdissoziation keine zwingende Vorraussetzung für Endozytose darstellt, wobei nicht ausgeschlossen werden kann, dass es sich bei den detektierten Komplexen um erst in vitro auf isolierten Organellen entstandene Komplexe handelt.