dc.contributor.advisor | Jahn, Reinhard Prof. Dr. | de |
dc.contributor.author | Siddiqui, Tabrez Jamal | de |
dc.date.accessioned | 2006-08-01T06:55:22Z | de |
dc.date.accessioned | 2013-01-18T14:25:09Z | de |
dc.date.available | 2013-01-30T23:51:13Z | de |
dc.date.issued | 2006-08-01 | de |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B5F0-D | de |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3230 | |
dc.description.abstract | Die Fusion synaptischer Vesikel mit der präsynaptischen Plasmamembran wird durch sogenannte SNARE-Proteine vermittelt. Die vorliegende Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis des Verhaltens des vesikelständigen SNARE-Proteins Synaptobrevin, sowohl in seiner nativen Organelle als auch in Liposomen rekonstituiert, bei. Die Reaktivität rekonstituierten Synaptobrevins ist bislang umstritten. So legten kürzlich durchgeführte Studien nahe, dass membranständiges Synaptobrevin nicht effizient in SNARE-Komplexe eingebaut wird (Hu et al., 2002; Kweon et al., 2003b). Deshalb habe ich die Bindungseigenschaften und die SNARE-Komplexbildungsreaktion auf Synaptobrevin exponierenden Membranen untersucht. So wie die lösliche Dömane bindet membranassoziiertes Synaptobrevin den SNAP-25/Syntaxin-Akzeptorkomplex, was zur Bildung eines stabilen, tetrahelikalen SNARE-Bündels führt. Kinetiksimulationen und Anpassung experimenteller Daten trugen dazu bei, den Reaktionsweg der SNARE-Komplexbildung auf Membranen aufzuklären. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen weisen darauf hin, dass es sich um eine robuste Reaktion handelt, die von den meisten endogenen und äußeren Faktoren wie Hirnzytosol, Membranfluidität, Chaotropizität, divalenten Ionen und der Lipidkomposition weitgehend unbeeinflusst bleibt, jedoch durch Anwesenheit schwacher Gegenionen signifikant verstärkt wird. In Einklang mit dieser Beobachtung ist auch die Einbaurate von in Liposomen rekonstituiertem Synaptobrevin in SNARE-Komplexe mit der auf synaptischen Vesikeln vergleichbar. Aufgrund ihrer hohen Reaktivität ist die Regulation von SNARE-Proteinen von hoher Bedeutung. Es ist gezeigt worden, dass Synaptobrevin in Membranen assoziiert an das Vesikelprotein Synaptophysin vorliegt, welches potentiell als SNARE-Regulatorprotein fungiert. Hier konnte ich zeigen, dass die Bindung von Syntaxin/SNAP-25 an Synaptobrevin in der Lage ist, dessen Assoziation an Synaptophysin aufzuheben.Drei monoklonale Antikörper, die sich gegen den ternären SNARE-Komplex nicht jedoch gegen die SNARE-Monomere richten, wurden erfolgreich hergestellt und mithilfe von Immunoblotting, Zellinien und Plasmamembran- Sheets charakterisiert. Ihre Bindungsstellen konnten kartiert werden. Desweiteren waren die Antikörper in der Lage, SNARE-Komplex-dissoziation in einem funktionellen Experiment zu inhibieren und können damit Einblick in die Dissoziationsmaschinerie geben. Auch könnte ihr Einsatz in anderen funktionellen Untersuchungen helfen, noch ausstehende Fragen zu beantworten. Außerdem wurden der Zustand sowie die Dynamik von SNARE-Komplexen in präsynaptischen Nervenendigungen untersucht. Dabei konnte ich zeigen, dass die SNARE-Komplexmengen in ruhenden und stimulierten Synaptosomen vergleichbar sind, was darauf hinweist, dass diese schnell wieder dissoziiert werden, sobald Exozytose stattgefunden hat. Einige SNARE-Komplexe konnten jedoch auf isolierten Organellen mittels Mikroskopie und Immunoblotting detektiert werden. Dieses könnte ein Hinweis darauf sein, dass Komplexdissoziation keine zwingende Vorraussetzung für Endozytose darstellt, wobei nicht ausgeschlossen werden kann, dass es sich bei den detektierten Komplexen um erst in vitro auf isolierten Organellen entstandene Komplexe handelt. | de |
dc.format.mimetype | application/pdf | de |
dc.language.iso | eng | de |
dc.rights.uri | http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html | de |
dc.title | SNARE assembly and regulation on membranes | de |
dc.type | doctoralThesis | de |
dc.title.translated | SNARE assembly and regulation on membranes | de |
dc.contributor.referee | Neher, Erwin Prof. Dr. | de |
dc.date.examination | 2006-06-15 | de |
dc.subject.dnb | 500 Naturwissenschaften | de |
dc.description.abstracteng | The fusion of synaptic vesicles with the pre-synaptic plasma membrane is mediated by SNARE proteins. This work provides key insights into the behaviour of synaptobrevin, the SNARE protein localized to synaptic vesicles, in its native membrane organelle and when it is reconstituted in liposomes. The reactivity of reconstituted synaptobrevin has remained controversial. Recent studies have suggested that synaptobrevin inserted in membranes does not readily engage in SNARE complexes (Hu et al., 2002; Kweon et al., 2003b). I therefore explored the binding characteristics and assembly pathway of the SNAREs on synaptobrevin-bearing membranes. Like its soluble domain, synaptobrevin anchored in membranes binds to the syntaxin/SNAP-25 acceptor complex to form the stable tetra helical coiled coil SNARE bundle. Kinetic simulations and fitting of experimental data helped unravel the SNARE assembly pathway on membranes. Monitoring the effects of endogenous and extraneous factors on SNARE complex assembly suggested that assembly is a robust process, largely unaffected by brain cytosolic factors, membrane fluidity, chaotropicity, divalent ions and lipid composition but is considerably enhanced in the presence of weak counter-ions. In agreement with these observations, SNARE complex assembly rate on liposomes reconstituted with synaptobrevin and on synaptic vesicles was comparable. Being highly reactive molecules, the regulation of SNAREs has considerable importance. Synaptobrevin has been found to be associated in membranes with synaptophysin, an abundant protein localized to the synaptic vesicle and a potential regulator of SNARE complex assembly. I showed here that syntaxin/SNAP-25 binding to synaptobrevin in synaptic vesicles causes its dissociation from synaptophysin.Three monoclonal antibodies recognizing the ternary SNARE complex, but not the monomers, were successfully raised and characterised in immunoblots, cell-lines and plasma-membrane sheets. Their binding sites on the complex were mapped. In a functional assay, the antibodies abolished disassembly of the SNARE complex thus providing insights into the disassembly machinery.The antibodies can be used in other functional assays to answer pertinent questions. The status and dynamics of SNARE complexes was probed in pre-synaptic nerve-terminals. I found that the amount of SNARE complex is comparable in resting and stimulated synaptosomes, suggesting that they rapidly disassemble immediately after exocytosis has occurred. Some amount of complex was, however, found on isolated organelles when monitored by direct imaging or immunoblotting, suggesting that rapid disassembly of the SNARE complex is not a pre-requisite for endocytosis, though it cannot be ruled out that complexes formed on isolated organelles in vitro. | de |
dc.contributor.coReferee | Brose, Nils Prof. Dr. | de |
dc.subject.topic | Molecular Biology & Neurosciences Program | de |
dc.subject.ger | SNAREs | de |
dc.subject.ger | synaptobrevin | de |
dc.subject.ger | Membranfusion | de |
dc.subject.ger | FRET | de |
dc.subject.ger | anisotropy | de |
dc.subject.ger | Synaptische Vesikel | de |
dc.subject.eng | SNAREs | de |
dc.subject.eng | synaptobrevin | de |
dc.subject.eng | membrane fusion | de |
dc.subject.eng | FRET | de |
dc.subject.eng | anisotropy | de |
dc.subject.eng | synaptic vesicles | de |
dc.subject.bk | 42.13 Molekularbiologie | de |
dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-781-2 | de |
dc.identifier.purl | webdoc-781 | de |
dc.affiliation.institute | Göttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und molekulare Biowissenschaften (GGNB) | de |
dc.subject.gokfull | WF | de |
dc.identifier.ppn | 579210669 | de |