Strukturelle Untersuchungen an Varianten des Ecballium elaterium Trypsin Inhibitors-II (EETI-II)

Abstract

Die Inhibitor-Cystinknoten-Familie enthält eine große Anzahl von kleinen, nur ca. 30 Aminosäuren umfassenden Mikroproteinen, die eine hohe Diversität hinsichtlich ihrer inhibitorischen Eigenschaften zeigen. Das charakteristische Strukturmerkmal dieser Naturstoffe ist der sogenannte Cystinknoten, durch den die Polypeptidkette über drei Cystinbrücken fixiert wird. Er ersetzt den hydrophoben Kern größerer Proteine und ermöglicht somit eine Faltung im konformationellen Sinne. Hierbei ist das erste Cystein mit dem vierten, das zweite mit dem fünften und das dritte mit dem sechsten Cysteinrest der Polypeptidsequenz verknüpft. Der 30 Aminosäuren lange Ecballium elaterium Trypsin Inhibitor-II (EETI-II) ist ein typischer Vertreter dieser Proteinfamilie. EETI-II wurde erstmals aus Samen des Kürbisgewächses Ecballium elaterium isoliert und hemmt Trypsin mit einer nanomolaren Dissoziationskonstante. Die hohe strukturelle Toleranz des Inhibitor-Cystinknotenmotivs gegenüber Nicht- Cystein Substitutionen macht EETI-II zu einem idealen Rahmenwerk für die Generierung von konformationell eingeschränkten Peptid-Bibliotheken, aus denen Varianten mit neuen Eigenschaften isoliert werden können. In diesem Projekt wurden Einkristalle von EETI-II gezüchtet, die mit Methoden der Röntgenstrukturanalyse vermessen wurden. Zur Untersuchung der nativen inhibitorischen Funktion wurde EETI-II im Komplex mit Trypsin aus dem Schweinepankreas kristallisiert, die Röntgenstruktur wurde bei einer Auflösung von 1.6 Å bestimmt. Die Strukturen von drei Faltungs-Varianten von EETI-II, die im c-terminalen loop mutiert waren, wurden ebenfalls im Komplex mit Trypsin untersucht. Ihre Röntgenstrukturen wurden mit denen des Wildtyps und ähnlichen Strukturen anderer Inhibitoren verglichen.