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Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von vegetal lokalisierten RNAs in der Xenopus laevis Oozyte

Identification and functional characterization of vegetally localized RNAs in Xenopus laevis oocytes

by Maike Claußen
Doctoral thesis
Date of Examination:2002-04-25
Date of issue:2002-08-28
Advisor:Prof. Dr. Tomas Pieler
Referee:Prof. Dr. Tomas Pieler
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1285

 

 

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Name:claussen.pdf
Size:6.72Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

The subcellular localization of mRNA molecules is an important mechanism for regulating gene expression at the post-transcriptional level. In Xenopus laevis oocytes, vegetally localized transcripts have been implicated to play a role in early embryonic patterning and cell fate determination. In order to isolate novel localized RNAs in Xenopus oocytes, a cDNA library which is enriched for vegetally and cortically localized transcripts has been constructed during this study. By whole mount in situ hybridization based screening of this library, several already known localized RNAs as well as four novel localized transcripts have been identified, which are localized by the so called early and late localization pathways. Another transcript localizes in so far unknown pattern to the equatorial region of the oocyte. The cis-acting elements of three of these RNAs, which mediate the vegetal transport, have been mapped to the 3´- and 5´-untranslated regions by microinjection experiments and comprise 75-300 nucleotides in length respectively. These RNA localization elements of early and late localizing transcripts show a differential protein binding in UV-crosslinking experiments with Xenopus oocyte extracts as well as in coimmunoprecipitation experiments with known localization element binding proteins (Vg1-RBP and Prrp).
Keywords: RNA localization; RNA transport; localization element; Xenopus laevis

Other Languages

Die subzelluläre Anreicherung von mRNA Molekülen stellt einen wichtigen Mechanismus der Genregulation in eukaryotischen Zellen dar. In der Xenopus laevis Oozyte üben lokalisierte mRNAs wichtige Funktionen bei der frühembryonalen Entwicklung und Determination von Zellschicksalen aus. Mit dem Ziel, neue in der Xenopus Oozyte vegetal lokalisierte RNA-Moleküle zu isolieren, wurde in der vorliegenden Arbeit eine cDNA Bibliothek erstellt, die angereichert vegetal-kortikal lokalisierte RNAs enthält. Diese wurde in einer whole mount in situ-Hybridisierungs-basierten Durchmusterung auf vegetal lokalisierte Transkripte durchsucht und so konnten neben der Reisolierung bereits bekannter lokalisierter Transkripte auch vier neue lokalisierte RNAs identifiziert werden, die sich aufgrund ihres charakteristischen Verteilungsmusters den sogenannten frühen oder späten Sortierungswegen zuordnen lassen. Ein weiteres Transkript lokalisiert in einer bisher nicht beschriebenen Weise am äquatorialen Kortex der Oozyte und ist somit einem neuen Lokalisationstyp zuzuordnen. In Mikroinjektionsexperimenten wurden die Lokalisationselemente drei dieser RNAs, die den vegetalen Transport einer Reporter-RNA entlang des frühen bzw. des späten Verteilungsweges vermitteln können, auf 75 bis 300 Nukleotide lange Bereiche in den 3´- bzw. 5´-untranslatierten Regionen eingegrenzt. Diese cis-agierenden Elemente weisen keine charakteristischen Konsensussequenzen auf, sondern bilden vermutlich spezifische Sekundärstrukturelemente aus, die dann von zellulären Transportfaktoren erkannt werden. In UV-Quervernetzung- und Koimmunopräzipitationsexperimenten konnte weiterhin nachgewiesen werden, daß die Lokalisationselemente von RNAs unterschiedlicher Sortierungswege ein differentielles Bindungsverhalten an Proteine aus Xenopus Oozyten Extrakten, sowie an bekannte Lokalisationselement-bindende Proteine (Vg1RBP und Prrp) aufweisen.
Schlagwörter: RNA Lokalisation; RNA Transport; Lokalisationselement; Xenopus laevis
 

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