Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von vegetal lokalisierten RNAs in der Xenopus laevis Oozyte
Identification and functional characterization of vegetally localized RNAs in Xenopus laevis oocytes
von Maike Claußen
Datum der mündl. Prüfung:2002-04-25
Erschienen:2002-08-28
Betreuer:Prof. Dr. Tomas Pieler
Gutachter:Prof. Dr. Tomas Pieler
Gutachter:Prof. Dr. Gerhard Braus
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
The subcellular localization of mRNA molecules is an important mechanism for regulating gene expression at the post-transcriptional level. In Xenopus laevis oocytes, vegetally localized transcripts have been implicated to play a role in early embryonic patterning and cell fate determination. In order to isolate novel localized RNAs in Xenopus oocytes, a cDNA library which is enriched for vegetally and cortically localized transcripts has been constructed during this study. By whole mount in situ hybridization based screening of this library, several already known localized RNAs as well as four novel localized transcripts have been identified, which are localized by the so called early and late localization pathways. Another transcript localizes in so far unknown pattern to the equatorial region of the oocyte. The cis-acting elements of three of these RNAs, which mediate the vegetal transport, have been mapped to the 3´- and 5´-untranslated regions by microinjection experiments and comprise 75-300 nucleotides in length respectively. These RNA localization elements of early and late localizing transcripts show a differential protein binding in UV-crosslinking experiments with Xenopus oocyte extracts as well as in coimmunoprecipitation experiments with known localization element binding proteins (Vg1-RBP and Prrp).
Keywords: RNA localization; RNA transport; localization element; Xenopus laevis
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Die subzelluläre Anreicherung von mRNA Molekülen
stellt einen wichtigen Mechanismus der Genregulation in
eukaryotischen Zellen dar. In der Xenopus laevis
Oozyte üben lokalisierte mRNAs wichtige Funktionen bei
der frühembryonalen Entwicklung und Determination von
Zellschicksalen aus. Mit dem Ziel, neue in der
Xenopus Oozyte vegetal lokalisierte RNA-Moleküle
zu isolieren, wurde in der vorliegenden Arbeit eine
cDNA Bibliothek erstellt, die angereichert
vegetal-kortikal lokalisierte RNAs enthält. Diese wurde
in einer whole mount in
situ-Hybridisierungs-basierten Durchmusterung auf
vegetal lokalisierte Transkripte durchsucht und so
konnten neben der Reisolierung bereits bekannter
lokalisierter Transkripte auch vier neue lokalisierte
RNAs identifiziert werden, die sich aufgrund ihres
charakteristischen Verteilungsmusters den sogenannten
frühen oder späten Sortierungswegen zuordnen lassen.
Ein weiteres Transkript lokalisiert in einer bisher
nicht beschriebenen Weise am äquatorialen Kortex der
Oozyte und ist somit einem neuen Lokalisationstyp
zuzuordnen. In Mikroinjektionsexperimenten wurden die
Lokalisationselemente drei dieser RNAs, die den
vegetalen Transport einer Reporter-RNA entlang des
frühen bzw. des späten Verteilungsweges vermitteln
können, auf 75 bis 300 Nukleotide lange Bereiche in den
3´- bzw. 5´-untranslatierten Regionen eingegrenzt.
Diese cis-agierenden Elemente weisen keine
charakteristischen Konsensussequenzen auf, sondern
bilden vermutlich spezifische Sekundärstrukturelemente
aus, die dann von zellulären Transportfaktoren erkannt
werden. In UV-Quervernetzung- und
Koimmunopräzipitationsexperimenten konnte weiterhin
nachgewiesen werden, daß die Lokalisationselemente von
RNAs unterschiedlicher Sortierungswege ein
differentielles Bindungsverhalten an Proteine aus
Xenopus Oozyten Extrakten, sowie an bekannte
Lokalisationselement-bindende Proteine (Vg1RBP und
Prrp) aufweisen.
Schlagwörter: RNA Lokalisation; RNA Transport; Lokalisationselement; Xenopus laevis