Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von vegetal lokalisierten RNAs in der Xenopus laevis Oozyte

Abstract

Die subzelluläre Anreicherung von mRNA Molekülen stellt einen wichtigen Mechanismus der Genregulation in eukaryotischen Zellen dar. In der Xenopus laevis Oozyte üben lokalisierte mRNAs wichtige Funktionen bei der frühembryonalen Entwicklung und Determination von Zellschicksalen aus. Mit dem Ziel, neue in der Xenopus Oozyte vegetal lokalisierte RNA-Moleküle zu isolieren, wurde in der vorliegenden Arbeit eine cDNA Bibliothek erstellt, die angereichert vegetal-kortikal lokalisierte RNAs enthält. Diese wurde in einer whole mount in situ-Hybridisierungs-basierten Durchmusterung auf vegetal lokalisierte Transkripte durchsucht und so konnten neben der Reisolierung bereits bekannter lokalisierter Transkripte auch vier neue lokalisierte RNAs identifiziert werden, die sich aufgrund ihres charakteristischen Verteilungsmusters den sogenannten frühen oder späten Sortierungswegen zuordnen lassen. Ein weiteres Transkript lokalisiert in einer bisher nicht beschriebenen Weise am äquatorialen Kortex der Oozyte und ist somit einem neuen Lokalisationstyp zuzuordnen. In Mikroinjektionsexperimenten wurden die Lokalisationselemente drei dieser RNAs, die den vegetalen Transport einer Reporter-RNA entlang des frühen bzw. des späten Verteilungsweges vermitteln können, auf 75 bis 300 Nukleotide lange Bereiche in den 3´- bzw. 5´-untranslatierten Regionen eingegrenzt. Diese cis-agierenden Elemente weisen keine charakteristischen Konsensussequenzen auf, sondern bilden vermutlich spezifische Sekundärstrukturelemente aus, die dann von zellulären Transportfaktoren erkannt werden. In UV-Quervernetzung- und Koimmunopräzipitationsexperimenten konnte weiterhin nachgewiesen werden, daß die Lokalisationselemente von RNAs unterschiedlicher Sortierungswege ein differentielles Bindungsverhalten an Proteine aus Xenopus Oozyten Extrakten, sowie an bekannte Lokalisationselement-bindende Proteine (Vg1RBP und Prrp) aufweisen.