Molekular-Dynamik-Simulationen zum Katalysemechanismus der Acetylcholinesterase
Molecular dynamics simulations towards the catalytic mechanism of acetylcholinesterase
by Matthias Müller
Date of Examination:2002-01-30
Date of issue:2002-02-14
Advisor:Prof. Dr. Helmut Grubmüller
Referee:Prof. Dr. Erwin Neher
Referee:PD Dr. Heinz-Jürgen Steinhoff
Referee:Prof. Dr. Reiner Kree
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Acetylcholinesterase plays an important role in the signal transmission in cholinergic synapses. The aim of this work is to obtain a better insight into the catalytic reaction mechanism of this enzyme at the atomic level.The enzyme hydrolyses about 25000 acetylcholine (ACh) molecules per second, and this approaches a rate close to the diffusion limit. The active site is located at the end of a 2 nm deep and narrow gorge, where ACh is hydrolysed into acetate and choline. ACh reaches the active site via this so called active site gorge. The path by which the products leave the active site, however, is unknown. The favoured mechanism for the product clearance of the active site is a back door. Such a back door has not been observed in x-ray structures up to now. Previous MD simulations already suggested well defined back doors but, surprisingly, those have been disproved by biochemical experiments.Therefore, in the first part of the thesis, a systematic search for such a back door is performed. To this aim the force field molecular dynamics simulation (MD) method conformational flooding (CF) is used. Because standard analysis tools failed in finding putative back doors, a new analysis tool (the pathfinder ) was developed to perform a systematic search for sterically possible and transiently open pathways in trajectories obtained from CF simulations.The results suggest that, instead of small sharply defined back doors, there exists a whole flexible region where the products of the catalytic reaction can leave the active site.The second part of this thesis aims at improving existing methods to describe and understand the hydrolysis reaction at the active site of AChE at the atomic level. In particular, a method is required to predict chemical reactions at the nanosecond simulation time scales that are accessible today. The force field based method of conformational flooding provides a systematic search method for reaction pathways, intermediate states and product states. However, force field based methods are not able to describe the breaking and formation of chemical bonds. Therefore, we extended CF to density functional based methods ( chemical flooding ) that can describe the behaviour of chemical bonds to sufficient accuracy. By construction, this method primarily predicts reaction pathways and product states, but it also yields a rough estimate of the activation free energy barrier.The chemical flooding method is first applied to two tough test systems, bicyclopropylidene and methylenecyclopropane, that exihibit surprising rearrangement reactions. Subsequently, predictions of rearrangement and fragmentation reactions were made for a larger molecule, [3]Rotane, that have not yet been characterized experimentally. The results of these predictions have inspired new experiments. Furthermore, the predicted reaction pathways and product states can be used to calculate free activation energy barriers with already established methods.With the development of chemical flooding we provide a tool that should enable future studies of enzymatic reactions like the catalytic reaction of the AChE at the atomic level.
Keywords: conformational flooding; chemical flooding; pathfinder; acetylcholinesterase
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Das Enzym Acetylcholinesterase (AChE) spielt eine
wichtige Rolle bei der Signalübertragung in cholinergen
Synapsen. Ziel dieser Arbeit ist es dazu beizutragen,
den katalytischen Mechanismus der AChE auf atomarer
Ebene besser verstehen zu können.Das Enzym hydrolisiert ca. 25000
Acetylcholin-Moleküle pro Sekunde und liegt damit nahe
am Diffusionslimit. Das aktive Zentrum, die
katalytische Triade, liegt am Ende einer ca. 2 nm
tiefen Schlucht, der sogenannten active site gorge .
Dort wird das Acetylcholin (ACh) in Essigsäure und
Cholin gespalten. Bekannt ist, wie das ACh in das
aktive Zentrum gelangt. Unbekannt dagegen ist der
Mechanismus, wie die Produkte der enzymatischen
Reaktion das aktive Zentrum wieder verlassen können.
Favorisiert wird zur Zeit das sogenannte back
door -Modell, welches besagt, dass die Produkte durch
Hintertüren freigesetzt werden, die in
Kristallstrukturen des Proteins jedoch bisher nicht
beobachtet wurden. Vorangegangene MD-Studien haben
kleine scharf voneinander getrennte Pfade
vorgeschlagen, die überraschenderweise von
biochemischen Mutationsexperimenten widerlegt wurden.
Mit der Kraftfeld-basierten Molekular-Dynamik
(MD)-Simulationsmethode des conformational flooding
(CF) wird in der vorliegenden Arbeit daher eine
gezielte Suche nach solchen möglichen Hintertüren in
der dynamischen Protein-Matrix durchgeführt. Da
Standard-Analyseverfahren bei der Suche nach
Hintertüren in den Trajektorien, die man durch
CF-Simulationen berechnet, vollkommen überfordert
waren, wurde ein Analysewerkzeug ( Pathfinder )
entwickelt, dass eine gezielte Suche nach sterisch
möglichen, transient geöffneten Pfaden wählbarer
Breite, in den Trajektorien ausführt.Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe,
dass eine komplette Region in der Protein-Matrix so
flexibel ist, dass die Produkte das aktive Zentrum dort
verlassen können, was auch die kontroversen Ergebnisse
aus vorangegangenen MD-Studien und den biochemischen
Experimenten erklären könnte.Weiterhin ist nicht bekannt, wie die eigentliche
Hydrolyse-Reaktion am aktiven Zentrum der AChE auf
atomarer Ebene abläuft. Zur Beschreibung dieser
enzymatischen Reaktion ist es notwendig, chemische
Reaktionen innerhalb heute zugänglicher
Simulationszeiten vorhersagen zu können. Für
Kraftfeld-basierte Methoden gibt es die Methode des CF,
die strukturiert nach Reaktionspfaden, Übergangs- und
Produktzuständen suchen kann. Allerdings können mit
Kraftfeld-basierten Methoden nicht das Brechen und
Schließen von chemischen Bindungen beschrieben werden.
Darum wird im zweiten Teil der Arbeit CF auf
Dichtefunktional-basierte Methoden, die das Verhalten
chemischer Bindungen genau genug wiedergeben können,
erweitert. Diese Methode nennen wir chemical
flooding . Chemical flooding wird zunächst an zwei
harten Systemen, die unerwartete
Umlagerungsreaktionen durchführen, getestet
Methylencyclopropan und Bicyclopropyliden. Die Methode
soll in erster Linie Reaktionswege und Produktzustände
finden, liefert aber trotzdem eine grobe Abschätzung
für Energiebarrieren.Danach werden erste Vorhersagen für Umlagerungs- und
Fragmentierungsreaktionen eines größeren Moleküls,
[3]Rotan, gemacht, welches experimentell noch nicht
genauer charakterisiert ist. Die Ergebnisse dieser
Vorhersagen werden benutzt, um neue Experimente zu
planen und gezielt in Reaktionsgemischen nach Produkten
dieser Reaktionen zu suchen. Weiterhin können die
bestimmten Reaktionswege, Übergangs- und
Produktzustände dazu verwendet werden die
Energiebarrieren der einzelnen Reaktionen mit
quantenmechanisch etablierten theoretischen Methoden zu
berechnen.Mit der Entwicklung der Methode des chemical
flooding ist nun die Grundlage gelegt, auch
enzymatische Reaktionen vorhersagen und theoretisch
beschreiben zu können. In nachfolgenden Arbeiten kann
dies nun z.B. auf die Acetylcholinesterase angewendet
werden.
Schlagwörter: conformational flooding; chemical flooding; pathfinder; Acetylcholinesterase