Molekular-Dynamik-Simulationen zum Katalysemechanismus der Acetylcholinesterase

Abstract

Das Enzym Acetylcholinesterase (AChE) spielt eine wichtige Rolle bei der Signalübertragung in cholinergen Synapsen. Ziel dieser Arbeit ist es dazu beizutragen, den katalytischen Mechanismus der AChE auf atomarer Ebene besser verstehen zu können.Das Enzym hydrolisiert ca. 25000 Acetylcholin-Moleküle pro Sekunde und liegt damit nahe am Diffusionslimit. Das aktive Zentrum, die katalytische Triade, liegt am Ende einer ca. 2 nm tiefen Schlucht, der sogenannten active site gorge . Dort wird das Acetylcholin (ACh) in Essigsäure und Cholin gespalten. Bekannt ist, wie das ACh in das aktive Zentrum gelangt. Unbekannt dagegen ist der Mechanismus, wie die Produkte der enzymatischen Reaktion das aktive Zentrum wieder verlassen können. Favorisiert wird zur Zeit das sogenannte back door -Modell, welches besagt, dass die Produkte durch Hintertüren freigesetzt werden, die in Kristallstrukturen des Proteins jedoch bisher nicht beobachtet wurden. Vorangegangene MD-Studien haben kleine scharf voneinander getrennte Pfade vorgeschlagen, die überraschenderweise von biochemischen Mutationsexperimenten widerlegt wurden. Mit der Kraftfeld-basierten Molekular-Dynamik (MD)-Simulationsmethode des conformational flooding (CF) wird in der vorliegenden Arbeit daher eine gezielte Suche nach solchen möglichen Hintertüren in der dynamischen Protein-Matrix durchgeführt. Da Standard-Analyseverfahren bei der Suche nach Hintertüren in den Trajektorien, die man durch CF-Simulationen berechnet, vollkommen überfordert waren, wurde ein Analysewerkzeug ( Pathfinder ) entwickelt, dass eine gezielte Suche nach sterisch möglichen, transient geöffneten Pfaden wählbarer Breite, in den Trajektorien ausführt.Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass eine komplette Region in der Protein-Matrix so flexibel ist, dass die Produkte das aktive Zentrum dort verlassen können, was auch die kontroversen Ergebnisse aus vorangegangenen MD-Studien und den biochemischen Experimenten erklären könnte.Weiterhin ist nicht bekannt, wie die eigentliche Hydrolyse-Reaktion am aktiven Zentrum der AChE auf atomarer Ebene abläuft. Zur Beschreibung dieser enzymatischen Reaktion ist es notwendig, chemische Reaktionen innerhalb heute zugänglicher Simulationszeiten vorhersagen zu können. Für Kraftfeld-basierte Methoden gibt es die Methode des CF, die strukturiert nach Reaktionspfaden, Übergangs- und Produktzuständen suchen kann. Allerdings können mit Kraftfeld-basierten Methoden nicht das Brechen und Schließen von chemischen Bindungen beschrieben werden. Darum wird im zweiten Teil der Arbeit CF auf Dichtefunktional-basierte Methoden, die das Verhalten chemischer Bindungen genau genug wiedergeben können, erweitert. Diese Methode nennen wir chemical flooding . Chemical flooding wird zunächst an zwei harten Systemen, die unerwartete Umlagerungsreaktionen durchführen, getestet Methylencyclopropan und Bicyclopropyliden. Die Methode soll in erster Linie Reaktionswege und Produktzustände finden, liefert aber trotzdem eine grobe Abschätzung für Energiebarrieren.Danach werden erste Vorhersagen für Umlagerungs- und Fragmentierungsreaktionen eines größeren Moleküls, [3]Rotan, gemacht, welches experimentell noch nicht genauer charakterisiert ist. Die Ergebnisse dieser Vorhersagen werden benutzt, um neue Experimente zu planen und gezielt in Reaktionsgemischen nach Produkten dieser Reaktionen zu suchen. Weiterhin können die bestimmten Reaktionswege, Übergangs- und Produktzustände dazu verwendet werden die Energiebarrieren der einzelnen Reaktionen mit quantenmechanisch etablierten theoretischen Methoden zu berechnen.Mit der Entwicklung der Methode des chemical flooding ist nun die Grundlage gelegt, auch enzymatische Reaktionen vorhersagen und theoretisch beschreiben zu können. In nachfolgenden Arbeiten kann dies nun z.B. auf die Acetylcholinesterase angewendet werden.