Kristallstrukturen der C2B-Domäne von Rabphilin-3A und der PP2C-ähnlichen Phosphatase tPphA von Thermosynechococcus elongatus BP-1
Crystal structures of the C2B domain of Rabphilin-3A and the PP2C-like phosphatase tPphA of Thermosynechococcus elongatus BP-1
by Christine Schlicker
Date of Examination:2006-06-05
Date of issue:2006-09-28
Advisor:Prof. Dr. George M. Sheldrick
Referee:Prof. Dr. George M. Sheldrick
Referee:Prof. Dr. Oliver Einsle
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The first part of this thesis deals with the x-ray crystal structure of the C2B domain of Rabphilin-3A, which includes part of the linker region between the C2A and C2B domain. The second part deals with the x-ray crystal structure of the PP2C-like phosphatase tPphA of Thermosynechococcus elongatus BP-1. Both structures could be solved after expression, purification and crystallisation of the native and Se-Met protein via MAD (multiple-wavelength anomalous dispersion). In both cases crystals in two different space groups were obtained which were compared to each other.C2 domains are intracellular protein moduls of about 130 amino acids. They contain a characteristic structure motif of an eight-stranded antiparallel β-sandwich and show high calcium ion affinity. They are involved in exocytosis and in the regulation of the neurotransmitter release in the synaptic vesicle cycle. Rabphilin-3A contains a Rab binding domain and two C2 domains (C2A and C2B). The NMR-structure of the C2B domain was already known. But since it could not explain the high calcium ion affinity the cystal structure of the C2B domain and part of the linker region were examined in this thesis. The crystal structure differs from the NMR-structure in the calcium binding site and explains the high calcium affinity by ideal coordination of the two calcium ions.Cyanobacteria are able to use nitrate, nitrite or ammonia as a nitrogen source (nitrogen assimilation) and molecular nitrogen for building biologically usable nitrogen compounds (nitrogen fixation). Both nitrogen assimilation and nitrogen fixation lead to the formation of ammonia which is the central starting point for the GS/GOGAT-cycle (glutamine synthetase/glutamat-2-oxoglutarat amidotransferase). This cycle is controlled via regulation of the glutamine synthetase which is taken over from the PII proteins. The PII proteins will be phosphorylated or dephosphorylated depending on the carbon-nitrogen balance of the cell to regulate the activity of the glutamine synthetase. Dephosphorylation is done by a PP2C-like phosphatase (PII phosphatase): tPphA. The structure of tPphA was examined via x-ray crystallography and compared with other PP2C-like phosphatases to get an idea of the catalytic mechanism. The high degree of similarity between tPphA and the bacterial phosphatase indicates a similar mechanism of the two phosphatases. The mechanism itself is yet unexplained in either cases.
Keywords: X-ray crystal structure analysis; MAD; Se-Met protein; C2 domain; phosphatase; synapse; PP2C; cyanobacteria; crystal structure; C2B; tPphA; PphA; Rabphilin-3A; Thermosynechococcus elongatus BP-1
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Die vorliegende Arbeit befaßt sich im ersten Teil
mit der Röntgenkristallstruktur der C2B-Domäne von
Rabphilin-3A , die auch einen Teil der linker-Region zwischen der C2A- und der
C2B-Domäne des Rabphilin-3A enthält, und im zweiten
Teil mit der Röntgenkristallstruktur der PP2C-ähnlichen
Phosphatase tPphA von Thermosynechococcus elongatus BP-1.
Beide Strukturen konnten nach Expression, Reinigung und
Kristallisation des nativen und Se-Met Proteins mittels
MAD (multiple-wavelength anomalous
dispersion) gelöst werden. In beiden Fällen
wurden Kristalle in zwei verschiedenen Raumgruppen
erhalten, die jeweils miteinander verglichen
wurden.C2-Domänen sind intrazelluläre, ca. 130 Aminosäuren
umfassende Proteinmodule, welche als charakteristisches
Strukturmerkmal ein achtsträngiges, antiparalleles
β-Sandwich aufweisen und zumeist eine hohe
Kalziumionen-Affinität zeigen. Sie sind sowohl an der
Exocytose, als auch an der Regulierung der
Neurotransmitterfreisetzung im synaptischen
Vesikelzyklus beteiligt. Rabphilin-3A enthält sowohl
eine Rab-Bindungsdomäne, als auch zwei C2-Domänen (C2A
und C2B). Die NMR-Struktur der C2B-Domäne war bekannt.
Da sie jedoch nicht die hohe Kalziumionen-Affinität
erklären konnte, wurde in dieser Arbeit die
Kristallstruktur der C2B-Domäne und ein Teil der
linker-Region mittels
Röntgenstrukturanalyse untersucht. Die Kristallstruktur
weicht in der Kalziumbindungsstelle von der
NMR-Struktur ab und erklärt durch ideale Koordination
der Kalziumionen die hohe Kalzium-Affinität.Cyanobakterien sind in der Lage, sowohl Nitrat,
Nitrit oder Ammonium als Stickstoffquelle zu nutzen
(Stickstoff-Assimilation), als auch aus molekularem
Stickstoff biologisch verwendbare
Stickstoffverbindungen aufzubauen
(Stickstoff-Fixierung). Sowohl Stickstoff-Assimilation
als auch Stickstoff-Fixierung führen zur Bildung von
Ammonium, welches als zentrales Ausgangsprodukt für den
GS/GOGAT-Zyklus (Glutamin-Synthetase/
Glutamat-2-Oxoglutarat-Amidotransferase) dient. Dieser
Zyklus wird über die Regulierung der
Glutamin-Synthetase kontrolliert, welche von den
PII-Proteinen übernommen wird. Die PII-Proteine werden
dabei je nach Kohlenstoff-Stickstoffbilanz der Zelle
entweder phosphoryliert oder dephosphoryliert, um in
die Aktivität der Glutamin-Synthetase einzugreifen. Die
Dephosphorylierung übernimmt eine PP2C-ähnliche
Phosphatase (PII-Phosphatase): tPphA. Die Struktur der
tPphA wurde in dieser Arbeit röntgenkristallographisch
untersucht und mit anderen PP2C-ähnlichen Phosphatasen
verglichen, um mögliche Rückschlüsse auf den
katalytischen Mechanismus ziehen zu können. Die hohe
Ähnlichkeit der tPphA mit der bakteriellen Phosphatase
deutet auf einen vergleichbaren Mechanismus der beiden
Phosphatasen hin, der jedoch in beiden Fällen ungeklärt
ist.
Schlagwörter: Röntgenstrukturanalyse; MAD; Se-Met Protein; C2-Domäne; Phosphatase; Synapse; PP2C; Cyanobakterien; Kristallstruktur; C2B; tPphA; PphA; Rabphilin-3A; Thermosynechococcus elongatus BP-1