Functions of TGF-β2 and GDNF in the Development of the Mouse Nervous System: Evidence from Double Mutant Mice

Abstract

Zusammenfassung: Ein großer Teil der neurowissenschaftlichen Forschung beschäftigt sich mit der Frage, welche Faktoren eine Rolle beim Überleben oder Sterben von Neuronen spielen. Es wurden eine Reihe neurotropher Faktoren identifiziert, die neuronales Überleben und Differenzierung fördern. Die Transformierenden Wachstumsfaktoren beta (TGF-ß) stellen eine Familie multifunktionaler Zytokine dar, zu deren Funktion die Kontrolle von Zell-Proliferation, Differenzierung und die Regulation von Überleben und Sterben einer Zelle gehören. Der aus glialen Zelllinien stammende neurotrophe Faktor (glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF) ist verwandt mit TGF-ß. Er fördert das Überleben verschiedener neuronaler Populationen, darunter dopaminerge Neurone des Mittelhirns und Motoneurone. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass synergistisch wirkende Wachstumsfaktoren neuronales Überleben deutlich besser fördern als die jeweiligen Faktoren alleine. Außerdem gibt es Hinweise, dass GDNF Ko-Faktoren benötigt um als neurotropher Faktor zu wirken. Die vorliegende Arbeit untersucht den Synergismus von TGF-ß2 und GDNF in vivo in TGF-ß2/GDNF-doppelt-defizienten Mäusen. Da TGF-ß2- bzw. GDNF-defiziente Mäuse während der Geburt sterben, wurden doppelt-heterozygote Tiere verpaart, um schließlich doppelt-defiziente Tiere für die Analyse zu erhalten. Das erwartete Verhältnis für diese Tiere war 1:16. Es wurden 270 Embryonen in den Embryonal-Stadien E12-E18 untersucht, von denen jedoch nur 11 anstatt der erwarteten 17 doppelt-defizient waren. Um die Hypothese zu untersuchen, ob TGF-ß und GDNF das Überleben von Neuronen synergistisch fördern, wurde eine Reihe neuronaler Populationen im Stadium E18 untersucht, das das letzte zugängliche Stadium vor dem Sterben der Tiere bei der Geburt war. Im Stadium E18,5 wurde eine signifikant erniedrigte Anzahl von Motoneuronen, sowie von Neuronen sympatischer und parasympatischer Ganglien beobachtet. Ein Verlust an parasympatischen Neuronen konnte bereits in GDNF-defizienten Mäuse beobachtet werden, wohingegen der Verlust von lumbalen Motoneuronen und Neuronen des oberen Halsganglions (superior cervical ganglion, SCG) einen eindeutigen Phänotyp der TGF-ß2/GDNF-doppelt-defizienten Mäuse darstellt. Diese Daten weisen daher auf einen synergistischen Effekt von TGF-ß und GDNF bei neuronalem Überleben von lumbalen Motoneuronen sowie von SCG-Neuronen hin.Sowohl TGF-ß als auch GDNF haben einen Überlebens-fördernden Einfluss auf dopaminerge Neurone des Mittelhirns. Deshalb wurde bei der Analyse besonders die Entwicklung dieser Neurone untersucht. Im Stadium E12,5 war die Anzahl dopaminerger Neurone in TGF-ß2-defizienten Mäusen (Tgfß2-/-) im Vergleich zu Wildtypen (Tgfß2+/+) signifikant verringert. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass TGF-ß2 eine Rolle bei der frühen Induktion dopaminerger Neurone spielt. Im Gegensatz zu den Ergebnissen im Stadium E12,5 konnten in späteren Stadien (E14,5 und E18,5) weder in Tgfß2-/-Gdnf +/-- oder Tgfß2+/-Gdnf -/--, noch in Tgfß2-/-Gdnf -/--Tieren Unterschiede in der Anzahl Tyrosinhydroxylase (TH)-positiver Zellen in der Substancia nigra Pars compacta (SNpc) und im ventralen tegmentalen Gebiet (VTA) gefunden werden. Dies könnte darauf hinweisen, dass die beiden Gene während dieser Zeitpunkte in vivo nur einen geringen Einfluss auf die Entwicklung dopaminerger Mittelhirn-Neurone haben, und erst bei der postnatalen Reifung des Systems wichtig sind. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass ein Jahr alte Tgfß2+/-- und Tgfß2+/-Gdnf +/--Tiere einen geringen Verlust (10 % bzw. 13 %) an dopaminergen Neuronen im Vergleich zur Kontrolle (Tgfß2+/+Gdnf +/+) aufweisen. Der Locus Caeruleus (LC) ist ein noradrenerger Kern, der bei neurodegenerativen Erkrankungen stark betroffen ist. In dieser Untersuchung konnte im Stadium E14,5 in Tgfß2-/--, Gdnf -/--, Tgfß2-/-Gdnf +/--oder Tgfß2+/+Gdnf -/-- Tieren kein signifikanter Unterschied in der Gesamtzahl der Neurone im Vergleich zur Kontrolle (Tgfß2+/+Gdnf +/+) festgestellt werden. Die Gesamtzahl der serotonergen Neurone war in TGF-ß2-defizienten (Tgfß2-/-) Tieren im Stadium E12,5 signifikant erniedrigt. Dies könnte auf einen Einfluss von TGF-ß2 in der frühen Induktion serotonerger Neurone hinweisen. Außerdem war die Anzahl serotonerger Neurone im paramedianen Raphe-Kern (PMR) bei Tgfß2-/-- und Tgfß2-/-Gdnf+/--Tieren im Stadium E18,5 im Vergleich zum Wildtyp signifikant erniedrigt. Die Quantifizierung rostraler 5-HT-positiver Zellen ergab weniger Zellen in den doppelt-defizienten Mäusen (Tgfß2-/-Gdnf -/-) im Vergleich zum Wildtyp, allerdings war der Unterschied statistisch nicht signifikant. Je einer der drei analysierten doppelt-defizienten Embryonen im Stadium E14,5 und E18,5 wies einen starken Verlust an rostralen 5-HT-positiven Neuronen auf, was auf eine unterschiedliche genetische Penetranz dieses Phänotyps hindeutet.Chromaffine Zellen entwickeln sich aus den gleichen Vorläufern wie sympatische Neurone. In dieser Arbeit wurden daher die Effekte von TGF-ß2 und GDNF auf Proliferation und Differenzierung chromaffiner Zellen untersucht. In den Stadien E14,5 und E18,5 wurde eine signifikante Zunahme von TH-positiven Zellen in Tgfß2-/-- und Tgfß2-/-Gdnf -/--Tieren im Vergleich zu Wildtypen (Tgfß2+/+) festgestellt, während die GDNF-defizienten Tiere keinen Unterschied aufwiesen. Im Stadium E15,5, aber nicht im Stadium E18,5 wurde in Tgfß2-/--Tieren eine deutliche Zunahme an chromaffinen Zellen gefunden, die positiv für das proliferative cell nuclear-Antigen (PCNA) positiv waren. Andererseits kam es zu einer Abnahme des Verhältnisses von Phenylethanolamin-N-methyltransferase (PNMT)-positiven zu TH-positiven Zellen in Tgfß2-/--Tieren im Stadium E18,5. Dies ist der erste Hinweis auf eine physiologische Bedeutung der Isoform TGF-ß2, die bislang nur in vitro als Faktor in der Regulation von Proliferation und Differenzierung von chromaffinen Zellen diskutiert wurde. Tgfß2+/+Gdnf -/-- und Tgfß2-/-Gdnf -/--Embryonen besitzen nur wenige enterische Neurone, wie durch Markierungen mit dem neuronalen Marker Neurofilament gezeigt werden konnte. In den Stadien E14,5 und E18,5 war außerdem die Retina von Tgfß2-/-Gdnf -/-- und Tgfß2-/-Gdnf +/--Tieren signifikant dicker als in den Wildtypen. Die doppelt-defizienten Tiere wiesen dabei im Stadium E18,5 eine komplette Ablösung der Retina vom darunter liegenden Pigmentepithel und eine Auffaltung der Retina (Colombom-Formation) auf . Die doppelt-defizienten Tiere (Tgfß2-/-Gdnf -/-) wiesen außerdem zusätzliche Phänotypen außerhalb des zentralen und peripheren Nervensystems auf, wie eine dünnere ventrale Körperwand, Defekte in der Muskelentwicklung und der Bildung von extrazellulärer Matrix, sowie eine beschleunigte Entwicklung der Backenzähne. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit ein einzigartiges Muster von Phänotpypen in TGF-ß2/GDNF-doppelt-defizienten Mäusen, von denen einige auf einen Synergismus zurückzuführen sind (z. B. in der Regulation des Überlebens von Motoneuronen und Neuronen des SCG). Außerdem kooperieren beide Faktoren wahrscheinlich bei der Produktion und der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix. Die Ergebnisse besitzen auch eine klinische Bedeutung, da sie die Grundlage für das Verständnis und damit die Behandlung von Motoneuronen-Defekten bis hin zu Augenerkrankungen bilden.